UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM GENÉTICA
Dissertação de Mestrado
MONITORAMENTO GENÉTICO RETROSPECTIVO DE
POPULAÇÃO OCUPACIONALMENTE EXPOSTA À RADIAÇÃO
IONIZANTE UTILIZANDO MARCADORES STR
BRÁULIO CANÇADO FLORES
ORIENTADOR: Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz, Ph.D.
CO-ORIENTADORA: Profª. Drª. Daniela de Melo e Silva
Goiânia - Go
2008i
UNIVERSIDADE CATÓLICA DE GOIÁS
PRÓ-REITORIA DE PÓS-GRADUAÇÃO E PESQUISA
MESTRADO EM GENÉTICA
MONITORAMENTO GENÉTICO RETROSPECTIVO DE
POPULAÇÃO OCUPACIONALMENTE EXPOSTA À RADIAÇÃO
IONIZANTE UTILIZANDO MARCADORES STR
BRÁULIO CANÇADO FLORES
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Genética da
Universidade Católica de Goiás, como
requisito parcial para obtenção do Título
de Mestre em Genética.
ORIENTADOR: Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz, Ph.D.
CO-ORIENTADORA: Profª. Drª. Daniela de Melo e Silva
Goiânia - Go
2008 ii
Ficha Catalográfica
F634m Flores. Bráulio Cançado.
Monitoramento genético retrospectivo de população
ocupacionalmente exposta à radiação ionizante utilizando
marcadores STR / Bráulio Cançado Flores. – 2008.
108 f.
Dissertação (mestrado) – Universidade Católica de Goiás,
Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa, Mestrado em
Genética, 2008.
“Orientador: Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz. Ph.D.”
“C-orientadora: Profª. Drª. Daniela de Melo e Silva”.
1. Radiação ionizante. 2. Microssatélites. 3. Liquidators.
4. Césio 137. 5. STR (Repetições Curtas em Tandem). 6.
Genética. Título.
CDU: 572.224(043.3) iii
BANCA EXAMINADORA DA
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aluno(a): Bráulio Cançado Flores
Orientador: Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz, Ph.D.
Co-Orientadora: Profª. Drª. Daniela de Melo e Silva
Membros Externos:
Titular: Professor Dr. Barry W. Glickman
Suplente: Professor Dr. Wagner Gouvêa dos Santos
Membros Internos:
Titular: Professora Dra. Maria Paula Curado
Suplente: Professor Dr. Breno de Faria e Vasconcellos
Curso de Mestrado em Genética
Universidade Católica de Goiás
Data: 27/06/2008 iv
Dedico este trabalho...
Aos meus pais queridos e à
minha irmã pelo apoio e
incentivo que me propulsionam
todos os dias da minha vida e
me revitalizam ante todas as
dificuldades.v
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Aparecido Divino da Cruz, “Peixoto”, por acreditar que um
bombeiro poderia transformar-se em geneticista, por ter se envolvido com a
Defesa Civil, por ter sonhado muitos dos meus sonhos, consolado muitos dos
meus sofrimentos e regozijado muito de minhas conquistas. Agradeço pela
compreensão, pela amizade, pela cumplicidade, pela lealdade, pela
competência e principalmente pela paciência em toda esta inusitada
experiência de formação.
Ao Cel QOCBM Uilson Alcântara Manzan, por ter depositado confiança
no oficial “maluco” que resolveu ser cientista e creditado a assinatura do Corpo
de Bombeiros a essa investigação científica.
À Profa
Dra
. Daniela de Melo e Silva, por ter sido o anjo que a providência
divina colocou em meu caminho para guiar-me pelas veredas da desconhecida
investigação genética. Agradeço por ter iluminado minha busca e se disposto a
enfrentar o desafio do aluno militar e sistemático que deveria se polir em
cientista. Muito obrigado pelo companheirismo, pela disponibilidade e
principalmente pelo seu maravilhoso exemplo.
Aos Coronéis Claiton Divino de Souza Coelho, Paulo Rocha Arantes e
aos Tenentes Coronéis Ismael José de Siqueira, Edmar de Sousa Lima e
Adenir José Ferreira de Jesus por terem acreditado que podíamos envolver a
Defesa Civil com a Genética e que essa união seria salutar e edificante.
À Profa
Angela Adamski da Silva Reis, M.Sc, por ter me aberto as portas
de um mundo jamais sonhado e desejado por mim, por ter se configurado em
mestre e amiga de muitas horas e, finalmente, por ter me apresentado a uma
família que me satisfiz muito em escolher e da qual para sempre quero ser
membro.
Aos colegas e amigos Maj QOC Sérgio Ribeiro Lopes, Cap QOC Pedro
Carlos Borges de Lira e 1º Ten QOC Hélio Loyola Gonzaga Júnior pelo vi
incentivo e pelo conhecimento que compuseram minha formação de bombeiro e
de defesa civil.
Às “minhas meninas”, Emília Oliveira Alves Costa, Luciana Abrahão
Ramos e Marília Gomes Ismar, pela amizade, pelo envolvimento, pelo
comprometimento, pela luz, pela vida e pela alegria que lhes são características
e compuseram ícones essenciais que movimentaram o coração e o cérebro
deste trabalho.
Aos Colegas do Replicon, em especial, Fabiano Ribeiro Borges, Eduardo
Rocha Pedrosa, Julles Cristiane Rodrigues da Silva, Luciana Pinheiro Vaz e
Raimundo da Silva Lima Júnior pelo auxílio na coleta das amostras e nos
conhecimentos cotidianos tão importantes na formação de um novo membro do
Núcleo.
Aos Oficiais e Praças do Corpo de Bombeiros Militar do Estado de Goiás
que confiaram e apoiaram minha nova empreitada numa área, em princípio,
estranha à nossa atividade.
Aos funcionários da Superintendência Leide das Neves Ferreira que
aceitaram, se acostumaram e receberam muito bem mais um integrante da
“família” SuLeide.
Aos professores dos Programas de Mestrado e Pós-graduação em
Genética da Universidade Católica de Goiás, por auxiliar com seus
conhecimentos e disponibilidade e pelo incentivo, constantemente presentes.
Aos amigos e colegas de mestrado, em especial, Priscilla Rosa Silva de
Almeida e Ricardo Goulart Rodovalho, pela paciência, cumplicidade, amparo e
incentivo tão importantes para que eu perseverasse na labuta diuturna em
busca da conclusão desta obra.
Aos voluntários que participaram da pesquisa, muitas vezes superando
seus traumas e preconceitos em prol do desenvolvimento científico e social.
Aos Funcionários da Universidade pela competência e carinho que
dignificam nosso trabalho e o tornam mais prazeroso. vii
“Que você substitua a facilidade pelo esforço;
que sempre encontre alegria ao escalar novas
montanhas; que jamais descanse da sua busca
pelo conhecimento; que deseje ser hoje um
pouco mais do que foi ontem e um pouco
menos do que será amanhã. Tudo isso fará de
você um ser humano completo e lhe trará a
verdadeira felicidade”.
Rabino Benjamin Blech – “Benção a um amigo” Sumário
Página
Figuras, Tabelas e anexos 9
Siglas, Símbolos e Abreviaturas 10
Resumo 11
Abstract 12
1. Introdução 13
1.1 O Atendimento à Ocorrência 14
1.2 Classificação do Desastre 16
2. Conhecimento Atual 18
2.1 Mutações 18
2.2 Repetições em Tandem 21
2.3 Radiação Ionizante 23
2.4 Os Trabalhadores do Acidente, ou Liquidators 25
3. Metodologia 27
3.1 Grupo Amostral 27
3.2 Extração e Quantificação das Amostras de DNA 29
3.3 Reações de PCR 29
3.4 Genotipagem dos Marcadores 30
3.5 Análise dos Dados Moleculares 31
3.6 Definição de Mutações Germinativas 34
3.7 Taxa de Mutação, Qui-quadrado e Doublig Dose 34
4. Resultados 36
5. Discussão 41
6. Conclusão 47
7. Referências Bibliográficas 49
8. Anexos 54 9
Figuras, Tabelas e Anexos
Página
Figura 1
Exemplo de como se dispôs no software a representação dos
tamanhos dos fragmentos para a análise de cada marcador. Neste
caso, observamos os alelos paternos (6,9), os maternos (6,7) e os
filiais (6,9), indicando a coincidência entre a geração parental e a
filial.
32
Figura 2
Exemplo de como se dispôs no software a representação dos
tamanhos dos fragmentos para a análise de cada marcador. Neste
caso, observamos os alelos paternos (11,14), os maternos (12,13) e
os filiais (10,13), indicando uma mutação de origem paterna
(11 10).
33
Tabela 1 Tipos de mutação gênica e seus mecanismos de ocorrência 20
Tabela 2
Características dos 16 marcadores STR utilizados para genotipagem
dos indivíduos ocupacionalmente expostos à radiação ionizante de
césio–137 em Goiânia
30
Tabela 3
Dados gerais dos eventos mutacionais de cada locus STR no grupo
ocupacionalmente exposto à radiação ionizante de césio–137 em
Goiânia
38
Tabela 4 Características do grupo ocupacionalmente exposto à radiação
ionizante de césio–137 em Goiânia 38
Tabela 5 Dados gerais dos eventos mutacionais de cada locus STR no grupo
controle 39
Tabela 6 Características do grupo controle, de acordo com o locus mutado e a
taxa de mutação/locus 39
Anexo 1 Questionário aplicado aos potencialmente expostos 54
Anexo 2 Termo de Consentimento Livre e Esclarecido 62
Anexo 3 Resolução 340 CNS/MS 65
Anexo 4 Resolução 347 CNS/MS 76
Anexo 5 Protocolo de coleta de sangue 80
Anexo 6 Protocolo de Extração de DNA 82
Anexo 7 Protocolo de PCR e Eletroforese 85
Anexo 8 Artigo Submetido à Publicação 87
Anexo 9 Comprovantes de Recebimento da Revista Científica 108 10
Siglas, Símbolos e Abreviaturas
APAE Associação de Pais e Amigos dos Excepcionais
CNS Conselho Nacional de Saúde
CODAR Codificação Brasileira de Desastres, Ameaças e Riscos
DNA Acido Desoxirribonucléico
EUA Estados Unidos da América
IGR Instituto Goiano de Radioterapia
LaGene Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular
MI Ministério da Integração Nacional
MD Manual de Desastres – Desastres Humanos
MS Ministério da Saúde
PNDC Política Nacional de Defesa Civil
STR Do Inglês, Short Tandem Repeats (Repetições Curtas em Tandem)
SULEIDE Superintendência Leide das Neves Ferreira 11
RESUMO
O acidente radiológico mais grave do ocidente aconteceu em setembro
de 1987, quando um aparelho de radioterapia contendo 50.9 TBq de Cs137Cl
foi removida das ruínas de uma clínica de radioterapia e em seguida, violada.
Este acontecimento criou a oportunidade de que se investigasse os efeitos
genéticos da radiação ionizante. Foi investigada a variabilidade genética em
12 loci microssatélites em 11 famílias de liquidators, que trabalharam nas
ações de defesa civil. Como grupo controle, utilizamos famílias sem potencial
de exposição à radiação ionizante, perfazendo 900 indivíduos analisados, da
mesma área do Estado de Goiás. Quando comparamos os grupos exposto e
controle, encontramos um incremento no número de novos alelos nos perfis
dos liquidators expostos. A taxa de mutação encontrada foi maior nas famílias
dos expostos do que no grupo controle. Estes resultados, associados a
anteriores, indicaram que a análise dos perfis alélicos dos liquidators pode
indicar a exposição à radiação ionizante, além de uma elevada taxa de
mutações de microssatélites poder ser atribuída a esta exposição
Palavras – chave: Radiação Ionizante, Microssatélites, Liquidators, Césio –
137, STR, Goiânia. 12
ABSTRACT
The most serious radiological accident occurred in the western
hemisphere and it happened in September of 1987, when a radiotherapy unit
containing 50.9 TBq of Cs137Cl was removed from an abandoned radiotherapy
clinic in the State of Goias, Brazil and it was subsequently disassembled. This
event provides an opportunity to assess the genetic effects of ionizing
radiation. We investigated the genetic variation of 12 microsatellite loci in 11
families of exposed liquidators, who worked at the civil defense procedures. As
a control group, non-exposed families, comprised of 900 individuals, from the
same area of Goias state were analyzed. When we compared the exposed and
control groups, we found an increase in the number of new alleles in the
offspring of the exposed liquidators. The mutation rate was found to be higher
in the exposed families compared to the control group. These results,
associated with previous studies, indicated that exposure to ionizing radiation
can be detected in offspring of exposed liquidators and also suggest that the
elevated microsatellite mutation rate can be attributed to radioactive exposure.
Keywords: Ionizing Radiation, Microsatellite, Liquidators, Cesium – 137,
STR, Goiania. 13
1. INTRODUÇÃO
O uso freqüente de fontes de radiação na medicina, na indústria e nas
usinas nucleares cria possibilidades de acidentes radioativos. Por outro lado, a
contribuição político-social e econômica do uso deste recurso de energia é
imensurável. Conseqüentemente o uso dos recursos radioativos, assim como
os acidentes decorrentes desta fonte de energia, tem recebido grande atenção
por parte da população. Entretanto, os cuidados básicos de radioproteção,
prevenção e controle de exposição às radiações, só há pouco tempo,
passaram a ser valorizados no território nacional, motivados, em parte, pelo
acidente radiológico ocorrido em Goiânia no ano de 1987 (da Silva, 2000).
Os acidentes radioativos podem envolver desde indivíduos isolados até
comunidades inteiras. O efeito agudo da exposição humana à radiação
ionizante pode não ser a morte celular, mas uma alteração permanente no
DNA e, assim, a célula passa a sobreviver com erros incorporados ao seu
genoma. Neste contexto, os efeitos genéticos da exposição podem perdurar
por várias gerações (da Cruz, 1997). Além dos conseqüentes efeitos físicos na
população exposta, a exposição individual à radiação resulta em agravos
emocionais, promovendo um incremento da ocorrência de doenças
psicológicas e elevação do nível de estresse dos indivíduos envolvidos no
evento (Miranda et al, 2005, Koscheyev et al, 1993).
Os efeitos biológicos da exposição aguda à radiação incluem
queimaduras e danos à pele. Já os efeitos da exposição crônica incluem danos
ao DNA, que podem resultar em doenças genéticas como o câncer (Brenner et
al., 2003, Montelone, 1998, da Cruz et al., 1997). As radiações ionizantes são 14
exemplos de agentes físicos mutagênicos que podem levar também ao
comprometimento dos mecanismos de reparo celular (Eot-Houllier, 2005) e ao
desenvolvimento de diversos tipos de câncer que variam de acordo com a
intensidade, local e tempo de exposição e tipo de radionuclídio (Ward, 2002,
Goldman, 1982).
A assistência às populações vitimadas por desastres compreende as
atividades logísticas, assistenciais e de promoção à saúde. As necessidades
de pronta resposta exigem um planejamento circunstanciado. Adicionalmente,
é de fundamental importância elaborar um programa minucioso que envolve
preparação dos órgãos locais de defesa civil. Nas situações de desastres que
envolvem agentes potencialmente genotóxicos é relevante conhecer os efeitos
genéticos e os riscos populacionais deste tipo de acidente, sobretudo para que
sejam propostas ferramentas e protocolos utilizados em planejamento de
contingência, que correspondem a táticas elaboradas a partir de uma hipótese
de desastre para reduzir o risco relativo das populações (BRASIL, 2008).
1.1 O ATENDIMENTO À OCORRÊNCIA
Em setembro de 1987, ocorreu no Brasil, na cidade de Goiânia, capital
do Estado de Goiás, a maior ocorrência envolvendo produtos radioativos do
país. O acidente foi causado pela ruptura de uma cápsula de césio – 137, por
pessoas leigas, que desconheciam a natureza do objeto e os riscos associados
à exposição humana a elementos radioativos. Após as medidas emergenciais
de controle e contenção do acidente e identificação dos indivíduos rádio -
acidentados, foram consideradas expostas à radiação 249 pessoas, além de 15
toda população da cidade ter sido afetada pelo desastre. Dos expostos, 14
indivíduos tiveram contaminação interna comprovada e exibiam danos graves à
saúde e, portanto, foram encaminhados à unidade especializada de tratamento
no Rio de Janeiro (BRASIL, 2004).
Além do envolvimento da população de uma forma geral, os
trabalhadores de defesa civil1
foram acionados para iniciar os trabalhos de
atendimento ao desastre que, em princípio, tratava-se de possível “vazamento
de gás tóxico”. Naturalmente, a preocupação principal dos trabalhadores
enviados aos locais do acidente foi com o que respiravam, e não com potencial
exposição de corpo inteiro à radiação ionizante, situação que só seria
identificada cerca de 13 dias depois da remoção do cabeçote de blindagem das
antigas premissas do Instituto Goiano de Radioterapia – IGR (Cavalcante apud
GOIÁS, 2002).
Mesmo depois de identificada a natureza do acidente, que envolvia
radiação ionizante e o risco de exposição ocupacional, os membros do Corpo
de Bombeiros e da Polícia Militar permaneceram no local cumprindo suas
atividades laborais. Durante a jornada de trabalho, executavam atividades de
lavagem de asfalto e remoção de rejeitos, cuidavam da segurança dos locais
atingidos e isolados pela equipe da Comissão Nacional e Energia Nuclear, que
também foi envolvida no atendimento emergencial e nos cuidados inicias com a
saúde da população e dos ambientes (GOIÁS, 2002).
1No presente contexto, defesa civil deve ser compreendida como o conjunto de ações
preventivas, de socorro, assistenciais e reconstrutivas destinadas a evitar ou minimizar
desastres, preservar a moral da população e restabelecer a normalidade social (BRASIL,
2008).16
1.2 CLASSIFICAÇÃO DO ACIDENTE
A Codificação Brasileira de Desastres, Ameaças e Riscos (CODAR)
definiu o acidente ocorrido como sendo integrante da categoria de desastres
humanos de natureza tecnológica. A categoria inclui acidentes que ocorreram
em conseqüência indesejável do desenvolvimento econômico, tecnológico e
industrial, que podem ser reduzidos em função do incremento de medidas
preventivas relacionadas, principalmente, com a segurança industrial. Os
desastres desta natureza também estão ligados ao incremento das trocas
comerciais, do tráfego de cargas perigosas e com o surto de crescimento
demográfico das cidades sem um desenvolvimento compatível e adequado da
estrutura de serviços essenciais (BRASIL, 2004).
Desastres humanos, de natureza tecnológica e relacionados com
produtos perigosos são mais comuns durante o transporte destes produtos, nas
plantas e distritos industriais, em instalações de mineração e campos de
petróleo e em parques e depósitos em conseqüência, muitas vezes, do uso ou
armazenamento irresponsável dos produtos. Ainda que sejam mais freqüentes
nos países desenvolvidos, a ocorrência dos desastres tecnológicos costuma
provocar maiores danos nos países em desenvolvimento, em função da maior
vulnerabilidade tecnológica, econômica e sócio-cultural, uma vez que, na
medida em que a sociedade melhora o seu senso de percepção de risco,
desenvolve um padrão de exigência mais acentuado e o governo é induzido a
priorizar seus deveres com relação à segurança global da população (BRASIL,
2004). 17
A capacidade que a sociedade tem de assimilar e os recursos que tem
para reagir a desastres com produtos perigosos devem ser observados e
levados em consideração numa tentativa de reduzir a vulnerabilidade social
aos desastres com produtos radioativos. Assim, os órgãos envolvidos com
atividades locais de defesa civil promoveriam a segurança contra este tipo de
desastre, além de conduzir auditorias periódicas para se determinar a
viabilidade dos procedimentos e garantir a confiabilidade à população sobre
qualquer empreendimento que ofereça riscos ao cotidiano das pessoas e
comunidades envolvidas (Castro, 2005).
Mais especificamente, o acidente com o cloreto de césio–137, ocorrido
em 1987 em Goiânia, foi classificado como um desastre relacionado com
substância e equipamentos de uso na medicina, categoria CODAR:
HT.PRM/21.507, em atividade de radiodiagnóstico, radioterapia ou medicina
nuclear (BRASIL, 2008). Durante um acidente que envolva risco de exposição
ocupacional à radiação os trabalhadores da segurança pública podem receber
altas doses de radiação, principalmente quando não se conhece a natureza do
material (Scott, 2005). No episódio goiano, o Governo do Estado de Goiás
entendeu, na Lei 14.226/2002, que o pessoal envolvido em defesa civil durante
o acidente deveria ser assistido. 18
2. CONHECIMENTO ATUAL
2.1 MUTAÇÕES
Ao longo da vida do ser humano o ácido desoxirribonucléico (DNA)
pode, espontaneamente, sofrer mutações, causadas por erros durante a
replicação na divisão celular (Ribeiro e Marques, 2003). As mutações ocorrem
devido a uma alteração gênica ou cromossômica que pode acarretar mudança
fenotípica trazendo consigo aspectos favoráveis ou desfavoráveis em função
do ambiente em que foram introduzidas (Westman, 2006).
O estudo de mutações pode levar a compreensão de diversos processos
biológicos e permitem ainda a compreensão destas alterações no material
herdável das espécies como sendo a principal componente da variabilidade
genética configurando um combustível da evolução (Lewin, 2001). Nos
organismos multicelulares as mutações são divididas em somáticas e
germinativas. As somáticas são as que ocorrem em células do corpo humano e
podem afetar seu portador, entretanto não serão transmitidas à prole,
característica fundamental na diferenciação das mutações germinativas, que
necessariamente são caracteres transmitidos à geração filial e que nem
sempre apresenta sinais nos portadores (Segal et al, 2001).
Mutações cromossômicas envolvem alteração na morfofisiologia dos
cromossomos. Podem afetar desde uma determinada região até um
cromossomo inteiro e traduzem-se em alterações estruturais, englobando as
translocações, deleções e inversões, ou numéricas, como é o caso das
euploidias e aneuploidias (Watson et al, 2007). Até hoje, constituem a principal 19
ferramenta de investigação genética de biodosimetria em monitoramentos
retrospectivos de acidentes que envolvem radiação ionizante (da Silva, 2000)
Mutações gênicas, como as descritas na tabela I, são alterações nas
seqüências de nucleotídeos do DNA e ocorrem devido à mudança de uma ou
mais bases nitrogenadas. Na espécie humana, são fundamentalmente
importantes por dois motivos: primeiro, são responsáveis pelas desordens
herdáveis e outras doenças como o câncer, que envolve alterações nos genes
e, segundo, são fontes de variações fenotípicas relacionadas à seleção natural
e à evolução (Watson et al, 2007).
Tabela 1 – Tipos de mutação gênica e seus mecanismos de ocorrência.
Tipo de Mutação Categoria da Mutação Mecanismo
Substituição Uma base é trocada por outra
Inserção
Uma ou mais bases são inseridas além
Estrutural da seqüência original
Deleção
Uma ou mais bases são removidas da
seqüência original
Non-sense
No ponto da mutação, o códon é
substituído por um códon de parada
Sense
A substituição de bases não acarreta em
mudança do aminoácido
Funcional
Missense
A substituição de bases acarreta em
mudança do aminoácido
Fonte: Watson et al, 2007
Segundo suas origens, as mutações podem ser espontâneas, sendo a
freqüência na qual elas ocorrem característica para cada organismo, ou ainda
induzidas, ocasionadas pela exposição do genoma aos agentes mutagênicos.
A mutagenicidade de um agente químico, físico ou biológico pode ser avaliada
de acordo com o aumento da freqüência de mutações induzidas em relação à
freqüência de mutações em nível basal (Westman, 2006). 20
Exemplos típicos de exposições mutagênicas são aquelas em que o
indivíduo é submetido a agentes químicos, luz ultravioleta ou radiação
ionizante. Esta exposição pode levar erros no DNA que ativarão os
mecanismos de reparo celular e poderão conduzir a célula à correção destas
alterações, à sobrevivência com erros incorporados ou à apoptose (Griffiths et
al., 2001).
A análise de alterações no material genético, em especial a
quantificação da freqüência de aberrações cromossômicas, micronúcleos, é
particularmente útil quando existem dificuldades na interpretação retrospectiva
de dados relativos à exposição individual, quando o indivíduo não possui um
histórico dosimétrico ou mesmo nas suspeitas de exposição acidental à
radiação (da Silva, 2000).
As informações de biomonitoramento podem indicar a possibilidade ou
suspeita da exposição a agentes genotóxicos podendo até, com o uso de
técnicas apropriadas, estimarem a magnitude do evento. A dosimetria biológica
usando marcadores é uma importante ferramenta na proteção radiológica, bem
como na indicação de exposição à radiação (da Cruz et al., 1995). 21
2.2 REPETIÇÕES EM TANDEM2
O Genoma humano é dividido dois grandes grupos. O primeiro é o grupo
dos genes e seqüências relacionadas, que ocupam aproximadamente a quarta
parte de todo o genoma e compreendem DNA codificante e DNA não
codificante. O DNA codificante são as seqüências que são traduzidas em
proteínas e itens constitutivos e metabólicos, já os não codificantes são os
íntrons, pseudogenes e seqüências não traduzidas. O segundo grupo é
constituído pelo DNA extragênico, que corresponde a todo o restante do
genoma e está distribuído em seqüências de cópia única, moderada e
altamente repetitiva. Entre as sequencias de aparições moderadas e altamente
repetitivas estão os elementos genéticos de transposição, ou transposons, o
DNA espaçador, os minissatélites e os microssatélites, também chamados
STR, do inglês short tandem repeats, ou repetições curtas em tandem (Snustad
e Simmons, 2008)
As repetições em tandem são cópias aleatórias de seqüências de DNA,
altamente variáveis, distribuídas ao acaso em todo genoma. Correspondem a
várias seqüências cerne de tamanhos diferentes e que se repetem em blocos
(Ellegren, 2000b).
Embora existam muitas seqüências em tandem constituintes de genes, a
maior parte não se caracteriza como codificante. As repetições em tandem são
excelentes marcadores genômicos pelo conhecimento dos já mapeados e por
suas inúmeras aparições (Nakamura et al, 1987). Os minissatélites e
2 Repetições em tandem são seqüências altamente variáveis de nucleotídeos encontradas na
maior parte dos eucariotos. Em humanos, a variabilidade destes fragmentos pode determinar o
vínculo genético, além de possuir outras utilizações particulares na medicina forense e legal
(Nikiforov et al., 1998).22
microssatélites (STR) são repetições menores que permitem, inclusive,
diferenciar pessoas (Watson et al, 2007) num mecanismo de avaliação que
aproxima o número de repetições de um determinado cerne de pais e filhos
possibilitando o estabelecimento de vínculo genético. Mutações nessas regiões
acontecem principalmente por slippage da polimerase, um mecanismo no qual
é inserido ou diminuído o número de repetições, que registra novos valores nos
filhos, muito próximos dos alelos paternos (Ellegren, 2000a). Recentemente, a
freqüência de mutações germinativas em STR tem sido usada para determinar
a exposição de indivíduos à radiação ionizante (da Cruz et al, 2008, Dubrova,
2003b), visto que as regiões de repetições em tandem têm alta sensibilidade
para sofrer mutações causadas pela exposição à radiação (Jeffreys et al, 2005,
Jeffreys, 1997).
Num primeiro momento, a análise de loci STR foi realizada em ratos
para determinar a associação entre exposição à radiação e taxas de mutação,
já num estágio posterior e como método consolidado, atualmente serve para,
inclusive, se estabelecer o risco genético da exposição à radiação, seja ela
aguda, crônica ou ocupacional. A observação de alelos de STR pode ser uma
estratégia eficiente de monitoramento de mutações radio-induzidas na
linhagem germinativa dos indivíduos expostos (Dubrova, 2003a).
Em termos práticos, a instabilidade de microssatélites foi observada em
casos de tumores de tireóide ocorridos na linhagem germinativa de pessoas
que trabalharam durante o acidente com a usina nuclear em Chernobyl em
1986 (Nikiforov et al, 1998).
Os dados obtidos com avaliação de repetições de DNA em tandem
mostraram-se muito úteis no monitoramento genético de mutações rádio 23
induzidas em humanos. Em populações da extinta União Soviética, foram
encontradas taxas particulares de mutações nas famílias dos expostos (Furitsu
et al, 2005, Dubrova, 2003b), mais tarde, foram utilizados com o mesmo êxito
em famílias expostas à radiação ionizante do césio–137 em Goiânia, no Brasil
(da Cruz et al, 2008).
2.3 RADIAÇÃO IONIZANTE
As radiações ionizantes são exemplos de agentes físicos mutagênicos
que podem levar ao comprometimento dos mecanismos de reparo celular (EotHoullier, 2005) e ao desenvolvimento de diversos tipos de câncer, incluindo os
tumores de tireóide, pulmão, mama e os tumores hematopoiéticos (Ward, 2002,
Goldman, 1982).
Os efeitos biológicos da exposição à radiação ionizante não dependem
do isótopo radioativo ao qual foi exposto o indivíduo, mas da dose absorvida
pelos tecidos, a quantidade recebida e a distribuição espacial da energia
transferida (Svensson, 1988). São conhecidos dois tipos de efeitos principais
da exposição à radiação: Os efeitos determinísticos, associados à morte
celular, como as queimaduras por radiação e os efeitos estocásticos,
associados à modificação celular, dentre elas o câncer e outras desordens
genéticas (Flakus, 1995).
A exposição à radiação ionizante pode induzir a diferentes formas de
instabilidade genômica, sendo estas mutações consideradas um potencial
marcador para distinguir os efeitos tardios da exposição à radiação (Nikiforov et
al, 1998). Num período embrionário, a exposição a agentes mutagênicos 24
podem levar a uma apresentação tardia de danos a saúde do indivíduo.
Particularmente, as mutações em células germinativas podem manifestar-se
apresentando doenças, deficiências e inclusive a morte (Aizawa et al, 2007).
O DNA, a exemplo de algumas moléculas, pode existir em pequenas
quantidades nas células, às vezes até como cópia única, e sua integridade
depende da manutenção dos processos metabólicos, da possibilidade de
divisão celular e da preservação da informação genética. Já moléculas como a
água, aparecem em quantidades bastante elevadas, representando até 70% da
massa celular (da Silva, 2000).
A Radiação Ionizante pode transferir sua energia diretamente para o
DNA, de forma a modificar sua estrutura, o que caracteriza o efeito direto da
radiação sobre o DNA. Em outros casos, a energia da Radiação é transmitida a
moléculas intermediárias da célula, na maioria das vezes, para moléculas de
água, causando um fenômeno de rádio-hidrólise3
. Nesse caso, o dano à
molécula de DNA corresponde ao efeito indireto das radiações ionizantes
(Leitão et al., 1994).
A radiação gama de césio–137 é um exemplo de radiação ionizante
freqüentemente usada em aparelhos de radiodiagnóstico. A maioria dos
desastres e acidentes provocados por equipamentos de radiologia relaciona-se
com erros humanos e com o descumprimento de normas de segurança
nacionais e internacionais estabelecidas por instituições reguladoras do uso da
radiação (BRASIL, 2004).
3
O fenômeno de rádio-hidrólise, neste contexto, ocorre quando a liberação da energia da
radiação quebra as moléculas de água presentes na célula, que forma produtos H+
e OHaltamente reativos que se ligam deliberadamente à molécula de DNA provocando alterações
na sua estrutura (da Silva, 2000). 25
2.4 OS TRABALHADORES DO ACIDENTE, OS LIQUIDATORS
O desastre na Usina Nuclear de Chernobyl, ocorrido em 1986, foi
acompanhado de uma disseminação grande de radioisótopos na atmosfera da
região. Em conseqüência, regiões da Ucrânia, Bielorrússia e da Federação
Russa foram exponencialmente contaminadas. As pessoas que moravam,
freqüentavam e trabalhavam nestas regiões foram as mais atingidas. Estudos
que compararam geneticamente as pessoas expostas a outras aparentemente
não irradiadas encontraram diferença significativa de alelos mutantes induzidos
pela exposição individual à radiação ionizante (Livshits et al, 2001). Nikiforov e
colaboradores (1998) descreveram a elevação na taxa de mutações de DNA
satélite da linhagem germinativa, observada nos filhos das pessoas que vivam
nas áreas próximas à Usina Nuclear e dos próprios trabalhadores que
ajudaram nas ações pós-desastre.
Os trabalhadores envolvidos no controle e contenção do acidente de
Chernobyl, chamados liquidators4
, apresentaram uma maior incidência de
alterações no DNA. No período que se seguiu ao acidente na Ucrânia, várias
pessoas foram expostas a diferentes doses de radiação (Fischbein et al, 1997).
De acordo com a gravidade da exposição individual, as pessoas foram
divididas em quatro grandes grupos e, um deles, contemplou os liquidators
que, incluía os trabalhadores que, de fato, auxiliaram na limpeza do local do
desastre e empenharam-se no restabelecimento dos serviços do local. Estes
trabalhadores tiveram uma exposição particular à radiação dado que
4
Liquidators foi o nome dado aos trabalhadores empregados nas ações de defesa civil,
segurança, limpeza, obras e infra-estrutura durante e após o acidente radioativo que envolveu
a explosão de um reator na Usina Nuclear de Chernobyl (Weinberg et al, 2001, Livshits et al,
2001). 26
trabalharam no isolamento, na confecção do “sarcófago” de concreto para o
reator danificado e na limpeza da área da usina, basicamente (Ivanov et al,
2004, Cristofaro et al, 2005).
Em Goiânia, em 1987, de modo semelhante à Chernobyl, um grupo de
trabalhadores de defesa civil atuou na assistência à população, na
descontaminação dos locais sinistrados e na escolta e guarda de rejeitos do
acidente radioativo com o césio–137. Os trabalhadores goianos foram
reconhecidos como ocupacionalmente expostos à radiação ionizante. O grupo
foi constituído, entre outros profissionais, de bombeiros e policiais militares que
atuaram nas diversas atividades durante e após a deflagração do acidente
(GOIÁS, 2002). 27
3. METODOLOGIA
3.1 GRUPO AMOSTRAL
Foram elaborados questionários (Anexo 1) e procedimentos de
investigação com o objetivo de avaliar retrospectivamente a exposição
potencial dos trabalhadores de defesa civil à radiação ionizante de césio–137
durante o acidente radiológico de Goiânia. Os questionários incluíam os termos
de consentimento livre e informado que foram assinados por todos os
participantes do estudo (Anexo 2).
A identificação dos trabalhadores candidatos à realização dos testes de
biomonitoramento foi feita mediante busca ativa aos registros do Corpo de
Bombeiros, da Polícia Militar do Estado de Goiás e da Superintendência Leide
das Neves Ferreira (SULEIDE) feitos por ocasião do acidente. Dessa forma,
foram selecionados militares que teriam trabalhado nas ações de defesa civil
durante o acidente com o césio–137, em 1987.
Para o presente estudo, foram levantados os nomes dos 187 policiais
militares e 17 bombeiros militares que constam da Lei Estadual 14.226/20025
e
dos 208 policiais e 158 bombeiros militares constantes de sindicâncias de suas
respectivas corporações que visam apurar os envolvidos nas ações de defesa
civil durante o acidente radiológico. Destes 570 militares, foram contatados 98
5
A Lei Estadual n. 14.226 de 08 de julho de 2002, publicada no Diário Oficial do Estado n. 18.952 de 19
de julho de 2002, requisita os valores das pensões especiais que especifica, dispões sobre a concessão de
pensões especiais às pessoas irradiadas ou contaminadas que trabalharam na descontaminação da área
acidentada com o césio–137, na vigilância do Depósito Provisório em Abadia de Goiás e no atendimento
de saúde às vítimas diretas do acidente e dá outras providências. 28
que se fizeram presentes na primeira reunião da Associação dos Militares
Vítimas do Acidente do Césio – 137, ocorrida em maio de 2007.
Dos contatados, fizeram adesão voluntária ao estudo 22 militares, que
tiveram filhos nascidos após o acidente. Dos participantes voluntários, 11
formaram o grupo amostral final analisado neste estudo, uma vez que não foi
possível, devido a problemas nas amostras, analisar todos os casos. Após a
assinatura do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE), 10 mL de
sangue periférico dos militares, de suas esposas e de pelo menos um de seus
filhos biológicos foram coletados por venipunção em tubos heparinizados. O
material biológico foi fracionado em hemácias, plasma e creme leucocitário,
armazenado entre -20ºC e -86ºC. O creme leucocitário foi usado,
subseqüentemente, para a extração e o isolamento do DNA genômico. Os
estudos foram conduzidos nos termos das Resoluções 340/2004 – CNS/MS e
347/2005 – CNS/MS (Anexos 3 e 4).
O grupo controle foi constituído de 900 casos de estudos de vínculo
genético, para os quais foram analisadas 12 loci STR por indivíduo, perfazendo
um total de 21.600 alelos pesquisados (900 indivíduos x 12 loci x 2 alelos por
locus em indivíduos diplóides). Todos os controles foram avaliados entre os
anos de 1998 a 2005. Os estudos de vínculo genético entre as famílias do
grupo controle foram realizados nos laboratórios da Associação de Pais e
Amigos dos Excepcionais (APAE), de Anápolis/GO, no Laboratório de
Citogenética Humana e Genética Molecular (LaGene) da Secretaria da Saúde
do Estado de Goiás, em Goiânia, e no Genetics Center Ltda, totalizando 800,
45 e 55 casos, respectivamente. Dos participantes foram coletados, por
venipunção, 5mL de sangue heparinizado por indivíduo. 29
3.2 EXTRAÇÃO E QUANTIFICAÇÃO DAS AMOSTRAS DE DNA
O DNA genômico foi purificado a partir de 350 µL de creme
leucocitário utilizando-se um kit comercial de extração de DNA (Easy® DNA
Purification Kit, Invitrogen, EUA), de acordo com as instruções do fabricante. A
concentração de DNA existente em cada amostra foi quantificada por análise
comparativa em géis de agarose a 1%, corados com brometo de etídio a
10ng/µL e comparada com o marcador de peso molecular Low DNA Mass®
(Invitrogen, EUA).
3.3 REAÇÕES DE PCR
As reações de amplificação foram realizadas para um volume final de
12,5 µL de solução contendo 100 ng de DNA, tampão da enzima livre de
magnésio 10x,10 ng de solução contendo 16 oligonucleotídeos fluorescentes
marcados com os fluoróforos FAN, HEX e NED (Tabela 2) e 0,5 U de Taq DNA
polimerase. O termociclador DNA IQ 5® (Biorad, EUA) foi utilizado nas reações
de amplificação, sendo programado para realizar as seguintes condições de
ciclagem: desnaturação inicial de 11 minutos a 95ºC e posteriormente de 2
minutos a 96ºC; 10 ciclos de 1 minuto a 94ºC, 1 minuto a 60ºC e 1minuto e 30
segundos a 70ºC cada; seguidos de 22 ciclos de 1 minuto a 90ºC, 1 minuto a
60ºC e 1 minuto e 30 segundos a 70ºC e finalmente, extensão final de 30
minutos a 60ºC . 30
Tabela 2 – Características dos 16 marcadores STR utilizados para genotipagem dos
indivíduos ocupacionalmente expostos à radiação ionizante de césio–137 em Goiânia.
Locus STR Localização Cromossômica Seqüência repetitiva (5’ 3’)
Penta E 15q AAAGA
D18S51 18q21.3 AGAA (21)
D21S11 21q11 - 21q21 TCTA Complexo (21)
TH01 11p15.5 AATG (21)
D3S1358 3p TCTA Complexo
FGA 4q28 TTTC Complexo (21)
TPOX 2p23 - 2pter AATG
D8S1179 8q TCTA Complexo (21)
vWA 12p12 - pter TCTA Complexo (21)
Amelogenin2 Xp22.1 - 22.3 e Y Não se Aplica
Penta D 21q AAAGA
CSF1PO 5q33.3 - 34 AGAT
D16S539 16q24 - qter GATA
D7S820 7q11.21 - 22 GATA
D13S317 13q22 - q31 TATC
D5S818 5q23.3 - 32 AGAT
Fonte: PowerPlex 16Bio – Tutorial, GE HealthCare, 2007.
3.4 GENOTIPAGEM DOS MARCADORES
Para a leitura dos produtos de PCR foi utilizado o seqüenciador
automático de DNA MEGABACE 1000® (Amersham Pharmacia Biotech, EUA).
Para tanto, 2 µL de cada produto de PCR foi diluído em 8 µL de uma solução
contendo 7,75 µL de solução de Tween 20 a 0,1% e 0,25 µL de ET-ROX® GE
HealthCare. Esse último reagente corresponde a um padrão de peso molecular
usado para alinhar as diferentes corridas nos diversos capilares. Após esse
procedimento, as amostras diluídas foram desnaturadas mediante aquecimento
a 95ºC durante 5 minutos, sendo logo em seguida colocadas em gelo, para a
manutenção da desnaturação das fitas duplas de DNA. Os parâmetros de 31
corrida do seqüenciador utilizados para injetar os fragmentos de PCR foram os
3kV / 80 segundos e 9kV / 75 minutos.
3.5 ANÁLISE DOS DADOS MOLECULARES
Para a análise dos dados obtidos com a corrida eletroforética no
seqüenciador automático foi utilizado o software Fragment Profiler v1.2® (GE
Healthcare, EUA). Uma vez configurados os parâmetros da leitura, o programa
exibia o padrão de leitura e os dados obtidos para cada amostra em forma de
eletroferogramas.
Inicialmente, foi selecionado o procedimento para a genotipagem
(Binning_AdvMicrosat_PeakPostProcessor), que torna o software aplicável ao
protocolo utilizado. Em seguida, um filtro para a definição do padrão foi
importado, visando estabelecer um referencial de leitura por peso molecular
(PowerPlex16bio_ET550.peakfilter.xml), ou seja, definir o que o programa
entenderia ser os tamanhos referência para a leitura das concentrações
colocadas como amostra. Para realizar as análises das amostras, os picos dos
fragmentos do marcador ET-ROX® GE HealthCare (ET-550 Size Standard)
foram selecionados e utilizados como parâmetros para cada leitura.
Em seguida, as amostras foram exibidas com o auxílio de
eletroferogramas, e os alelos amplificados ficaram dispostos em formas de
picos.
Os perfis alélicos dos fragmentos analisados, contendo seus respectivos
pesos moleculares, foram representados em forma de picos, que uma vez
alinhados, eram comparados em cada família e, uma vez estabelecidos o 32
índice de paternidade de, no mínimo 99,99%, foi investigada a presença de
possíveis mutações germinativas.
Figura 1 – Exemplo de como se dispôs no software a representação dos tamanhos dos
fragmentos para a análise de cada marcador. Neste caso, observamos os alelos paternos
(6,9), os maternos (6,7) e os filiais (6,9), indicando a coincidência entre a geração
parental e a filial. 33
Figura 2 – Exemplo de como se dispôs no software a representação dos tamanhos dos fragmentos para a análise de cada marcador. Neste caso,
observamos os alelos paternos (11,14), os maternos (12,13) e os filiais (10,13), indicando uma mutação de origem paterna (11 10). 34
3.6 DEFINIÇÃO DE MUTAÇÕES GERMINATIVAS
Para analisar possíveis mutações germinativas e inferir se a exposição
ocupacional ao césio–137 ocasionou mudanças nos tamanhos dos cernes de
repetição dos loci de microssatélite, famílias compostas por pai-mãe e filho
tiveram seus perfis alélicos comparados. Uma variante em uma criança que
não era observada em ambos os pais biológicos foi considerada como uma
mutação germinativa de novo. Como sugerido por Dubrova et al. 2006, o alelo
considerado como o do progenitor, foi o que apresentou o tamanho, em pares
de base, mais próximo ao do alelo mutante.
3.7 TAXA DE MUTAÇÃO, QUI-QUADRADO E DOUBLING DOSE
Para confrontar os dados das mutações encontradas no grupo exposto,
foi preciso calcular a taxa de mutação nos loci específicos. A taxa de mutação
foi obtida com a razão entre o número de mutações encontradas na geração
seguinte e o número total de alelos analisados na geração parental, pois o
quantitativo de mutações nos filhos dos expostos refere-se àquele número que
não coincidiu com o ponto de partida, ou seja, o genoma parental.
Para se avaliar o risco potencial da exposição ao césio–137, a dose
dupla foi avaliada. Esta dose é definida como a quantidade de radiação
necessária para se produzir um número significativo de mutações, como as
que ocorrem em uma geração, resultado de mutações espontâneas. Esta dose
pode ser calculada pela razão entre as taxas de mutações espontâneas e 35
induzidas em um set de loci gênicos definido, a partir de uma quantidade
estimada de radiação (Sankaranarayanan e Chakraborty, 2000).
Testes do qui-quadrado (BioEstat 3.0) foram realizados visando avaliar
possíveis diferenças estatisticamente significativas (p< 0.05), entre os grupos
exposto e controle tomando-se como esperado o grupo controle e como
observado o grupo exposto, relacionadas ao número de mutações
germinativas, idade dos progenitores, tamanho do cerne de repetição e taxas
de mutação. 36
4. RESULTADOS
Foram obtidos resultados de 07 bombeiros e 04 policiais, todos
participantes de reuniões da Associação dos Militares Vítimas do Acidente com
o césio–137. A média de idade dos pais, quando o acidente ocorreu era de 26
anos e a média de idade das mães era de 21 anos. Como grupo controle,
foram utilizados 300 trios, ou seja, 900 indivíduos que residiam no Estado de
Goiás e que realizaram exames de vínculo genético, visando estabelecer a
taxa de mutações germinativas em 12 loci STR.
No grupo exposto, dos 16 marcadores STR utilizados, 12 (75%) foram
informativos, ou seja, apresentaram leituras confiáveis ao eletroferograma
(Tabela 3). As reações de genotipagem dos 16 marcadores foram realizadas
em duplicata e foram considerados apenas os resultados dos casos que
demonstraram reprodutibilidade e clareza nos perfis alélicos, após a
visualização do marcador utilizado como padrão em todas as leituras (ETROX). Desta forma, foram genotipados 528 alelos e a grande maioria das
mutações observadas nos microssatélites representou perda do cerne de
repetição (Tabela 4 e Figura 2). As Tabelas 3 e 4 destacam as características
dos grupos exposto, quanto aos números de mutações paternas e/ou maternas
e quanto às taxas de mutação germinativa por marcador, respectivamente. As
Tabelas 5 e 6 demonstram os dados do grupo controle. 37
Tabela 3 – Dados gerais dos eventos mutacionais de cada locus STR no grupo
ocupacionalmente exposto à radiação ionizante de césio–137 em Goiânia.
Locus STR
Número de
mutações paternas
Número de
mutações maternas
Número de
mutações paternas
e/ou maternas
D18S51 - - -
Penta E 1 - -
TH01 1 - -
CSF1PO 1 1 -
D13S317 1 - -
D5S818 1 - -
D8S1179 - - 2
Amelogenin - - -
D3S1358 - - -
FGA 2 - -
TPOX 1 - -
vWA - - -
Total 8 1 2
Tabela 4 – Características do grupo ocupacionalmente exposto à radiação ionizante de
césio–137 em Goiânia.
Caso
Alelos
maternos
Alelos do
fillho
Alelos
paternos
Locus
mutado
Taxa de
mutação
F1.033 12,13 10,13 11,14 Penta E 0,023
F1.080 7,9 7,8 9,11 TH01 0,023
F3.073 11,13 10,11 12,12
F1.036 13,14 11,12 11,12
CSF1PO 0,045
F1.080 12,12 11,12 12,13 D13S317 0,023
F1.080 10,12 10,13 12,14 D5S818 0,023
F1.024 13,14 12,13 13,14
F2.025 13,14 12,14 13,14
D8S1179 0,045
F1.025 20,23 23,23 20,24
F1.033 21.2,21.2 21.2,25 23,26
FGA 0,045
F2.037 8,12 12,13 11,12 TPOx 0,023 38
Tabela 5 – Dados gerais dos eventos mutacionais de cada locus STR no grupo controle.
Locus STR
Número de
mutações
paternas
Número de
mutações
maternas
Número de
mutações
maternas e/ou
paternas
Número de
crianças
analisadas/alel
os analisados
D7S820 2 - -
D13S317 1 1 1
D16S539 2 - -
CSF1PO - - -
TPOx - - -
Th01 - - -
F13A01 - - -
FESPS - - -
Vwa 2 - -
LPL - - 1
F13B - - -
HPRTB - - -
300/3600
Total 7 1 2
Tabela 6 – Características do grupo controle, de acordo com o locus mutado e a taxa de
mutação/locus
Caso
Alelos
maternos
Alelos da
criança
Alelos
paternos
Locus
mutado
Taxa de
mutação
A74 11,13 12,13 11,11
A143 11,12 10,12 9,12 D16S539 0,0002
A103 8,12 8,11 10,12
A112 8,10 10,11 12,12 D7S820 0,0001
A91 11,14 9,13 9,11
A161 11,11 9,10 9,10 D13S317 0,0002
A488 9,14 8,13 8,12
A117 17,18 15,18 16,17
A773 14,16 11,14 15,16 vWA 0,00007
A655 9,10 10,11 10,10 LPL 0,00007
O grupo exposto continha 39 indivíduos, perfazendo um total de 1248
alelos analisados. Destes alelos, 936 (75%) foram informativos, apresentando
clareza e reprodutibilidade. Foram encontradas 11 mutações germinativas e uma 39
taxa de mutações de 0,02 (Tabela 4). Os loci CSF1PO, D8S1179 e FGA
apresentaram 2 mutações cada (Tabela 3). Com exceção da amelogenina, vWA
e D18S51 que não apresentaram mutações, os demais marcadores
apresentaram apenas 1 evento mutacional (Tabela 3). Das onze mutações
observadas, 8 (73%) eram de origem paterna, 2 (18%) de origem paterna ou
materna e apenas 1 (9%) foi de origem materna. Em apenas 1 das 8 mutações
de origem paterna, houve ganho no cerne de repetição, referente ao marcador
FGA. As demais mutações representaram perda no cerne de repetição, inclusive
a mutação de origem materna. A idade média das mães e dos pais deste por
ocasião do acidente foi de 21 e 26 anos e a média de idade na ocasião da
concepção dos filhos foi de 27 e 31 anos, respectivamente.
No grupo controle, 900 indivíduos foram analisados, perfazendo um total
de 21.600 alelos. Foram encontradas 10 mutações germinativas e uma taxa de
mutações de 0,0007 (Tabela 6). O locus D13S317 foi o marcador com o maior
número de mutações apresentando 3 eventos mutacionais (Tabela 5). Nos
marcadores D16S539 e D7S820 foram verificadas 2 mutações, enquanto que
nos marcadores vWA e LPL foram detectadas apenas 1 mutação (Tabela 5).
Neste grupo, 7 mutações eram de origem paterna, 1 de origem materna e 2
mutações poderiam ter origem tanto da materna quanto paterna. Todos os
resultados dos exames de vínculo genético dos grupos exposto e controle
apresentaram um índice de paternidade de 99,99%. A idade média das mães e
dos pais deste grupo foi de 24 e 31 anos, respectivamente.
O teste do qui-quadrado demonstrou que tanto as idades paternas,
quanto as idades maternas, no grupo exposto e controle, não tiveram efeito na
freqüência de mutações germinativas da prole (p=0,16 e p =0,17, 40
respectivamente). O efeito do cerne de repetição, na taxa de mutações
germinativas, em ambos os grupos, também foi investigado. Contudo,
nenhuma evidência do tamanho do cerne de repetição dos marcadores STR
nas taxas de mutação foi observada (p=0,24).
A maioria dos eventos mutacionais, em ambos os grupos exposto e
controle, envolveu a perda de apenas uma unidade de repetição. Apenas no
grupo controle houve 1 caso em que a criança perdeu 4 nucleotídeos. Dessa
forma, a incidência de mutações, envolvendo ganho ou perda de unidades de
repetição foi indistinguível em ambos os grupos (10 perdas versus 1 ganho no
grupo exposto; contra 7 perdas, 1 ganho e em 2 casos pode ter ocorrido perda
ou ganho; χ
2
= 3.6, g.l.=10 P= 0,96 ). Assim, pode-se concluir que houve
diferenças estatisticamente significativas, quanto à taxa de mutações
germinativas, em loci STR, entre os grupos estudados. 41
5. DISCUSSÃO
Vários estudos têm detectado e observado os efeitos potenciais da
radiação ionizante no material genético (DNA) de filhos de sobreviventes de
acidentes radioativos (da Cruz et al. 2008; Dubrova et al., 2006; Furitsu et al.,
2005; Kodaira et al., 2004; Slebos et al., 2004; Kiuru et al., 2004; Weinberg et
al., 2001). Alguns destes estudos utilizaram marcadores microssatélites e
minissatélites visando detectar alterações nos gametas paternos e maternos
que pudessem ser transmitidos para a prole (da Cruz et al., 2008; Dubrova et
al., 2006).
Marcadores STR são altamente polimórficos e apresentam taxas de
mutação maiores do que seqüências codificantes, uma característica que os
torna eficientes no rastreamento de efeitos genéticos, induzidos por agentes
mutagênicos (da Cruz et al., 2008; Dubrova et al., 2006). Sabe-se que a
exposição à radiação aumenta a freqüência de mutações em estudos
experimentais, mas os efeitos da radiação na indução de mutações
germinativas em humanos ainda permanece indefinida (da Cruz et al., 2008;
Dubrova et al., 2006; Furitsu et al., 2005; Kodaira et al.,2004).
Neste estudo foram encontradas 11 mutações na prole da geração
parental exposta ocupacionalmente ao césio–137, há aproximadamente vinte
anos, durante o acidente radiológico de Goiânia – GO. O grupo exposto foi
composto por 39 indivíduos e o grupo controle por 900 indivíduos. De acordo
com os resultados obtidos, há evidência de que a radiação aumentou a
freqüência de mutações nos loci STR em 29 vezes (taxa de mutação nos 42
expostos/taxa de mutação nos controles, 0,02 / 0,0007), na prole dos
indivíduos expostos.
Os resultados obtidos neste estudo são bastante semelhantes aos
resultados de da Cruz et al., 2008. Naquele estudo, foram detectadas 10
mutações na geração parental, da qual ambos os genitores haviam sido
expostos acidentalmente à radiação ionizante de césio–137.
Quanto às mutações encontradas no presente estudo, foi verificado que
91% eram de origem paterna, uma vez que somente os pais trabalharam nas
ações de socorro, segurança e reconstrução das vítimas do acidente do césio–
137. Embora outros estudos tenham relatado uma distribuição eqüitativa
destes valores entre pais e mães (da Cruz et al, 2008), o grupo dos bombeiros
e policiais era, na época, exclusivamente de homens que, declararam em suas
entrevistas, que suas esposas não estiveram nos locais onde se guardavam os
rejeitos radioativos.
Ainda de acordo com da Cruz et al. 2008, como relatado anteriormente,
o aumento das taxas de mutações nos loci microssatélites, da geração
parental, exposta ao césio–137, estaria relacionado a exposição à radiação.
Naquele estudo, foram detectadas taxas de mutação em torno de 0,02, com a
utilização de 12 loci microssatélites, neste estudo as taxas de mutação
também apresentam este valor. Estes resultados estão dentro do esperado,
uma vez que os oficiais envolvidos no socorro das vítimas também foram
expostos ao césio–137, mas não há registros das doses absorvidas por este
grupo.
As análises deste estudo foram realizadas com 16 marcadores, todavia,
foram selecionados os 12 marcadores STR mais específicos e de maior 43
reprodutibilidade, cujos resultados foram confiáveis, e apresentaram o mesmo
número de regiões analisadas em estudos anteriores.
Dado o tamanho do grupo exposto no estudo, foram obtidas taxas de
mutação consideravelmente altas, quando os resultados são comparados com
o grupo controle. E, considerando o número de trabalhadores de defesa civil
envolvidos no desastre, a amostra mostra-se de tamanho significativo, pois
representa cerca de 2% da quantidade total de indivíduos empregados pela
Defesa Civil para trabalhar na ocorrência.
Na aplicação dos questionários foi verificado que os bombeiros e
policiais militares do Estado de Goiás foram empregados em diversos serviços
durante o atendimento à ocorrência. Os bombeiros foram empregados,
prioritariamente, na lavagem das ruas e avenidas onde havia focos de material
radioativo e nos lotes com rejeitos, além da remoção de vítimas e atenção às
populações das circunvizinhanças dos focos que, expostas ou não à radiação,
requeressem atendimento pré-hospitalar ou remoção para algum centro
especializado de saúde. Os policiais militares foram, principalmente,
incumbidos da segurança dos locais sinistrados bem como dos materiais e
rejeitos que lá estavam, da segurança dos comboios que transportavam
vítimas e rejeitos e, por fim, de assegurar os depósitos provisórios e definitivos
dos rejeitos radioativos, além, é claro, de conter revoltas pontuais de uma
população assustada e enfurecida pelo ocorrido.
Tanto bombeiros quanto policiais declararam que nem todo pessoal que
trabalhava nas zonas irradiadas, principalmente eles, dispunha de
equipamentos e vestimentas especiais para desempenhar suas funções e que,
muitas foram as vezes em que suas fardas chegavam às suas casas sujas de 44
rejeitos e eram misturadas com outras roupas usadas por seus familiares,
todas lavadas por suas mães e esposas. Eles relataram também, não terem
sido assistidos do ponto de vista de saúde e que não foram submetidos a
nenhum tipo de dosimetria durante o acidente, para que constasse em seus
registros a exposição a doses de radiação.
Não foi possível precisar o número real de bombeiros e policiais
militares potencialmente expostos à radiação ionizante durante o acidente
radioativo do césio–137 em Goiânia em 1987, pois na época, o Corpo de
Bombeiros Militar do Estado de Goiás era apenas uma fração da Polícia Militar
do Estado. Além disso, ocorria um Curso de Formação de Soldados da Polícia
Militar e, como era habitual, sem prévio aviso, quando havia necessidade
emergencial de emprego nas ruas, os alunos eram empenhados no serviço, no
intuito de buscar uma melhor resposta à ocorrência e oferecer uma atuação
mais eficaz, uma vez que estes alunos já tinham um determinado nível de
formação que os permitiria atuar, assistidos por seus tutores policiais,
complementando a força tarefa. Como ocorreu isso com o acidente, sabe-se
que, além dos policiais militares e bombeiros envolvidos, os alunos da turma
de 1987 foram empregados, não se pode especificar, ao certo, quem, quando,
onde e por quanto tempo.
Embora membros de instituições militares, normalmente fechadas
ideologicamente, os policiais e bombeiros que foram voluntários para participar
da pesquisa demonstraram, além das dores e marcas psicológicas do acidente
com o césio–137, uma iniciativa inédita de envolvimento individual e
corporativo com a pesquisa científica. Demonstraram envolvimento com a
causa e interesse no sentido de investigar as razões para que lições fossem 45
aprendidas e ferramentas desenvolvidas para a proteção e segurança global
da população, como é previsto na Política Nacional de Defesa Civil, cujo apelo
pela pesquisa científica visa, entre outras razões, o esclarecimento operacional
e o planejamento de contingência.
Figuram nas leis que aprovaram as pensões para o pessoal que
trabalhou no ocorrido 17 bombeiros e 187 policiais militares. Além de,
aproximadamente, mais 200 policiais e 150 bombeiros em sindicâncias e
procedimentos administrativos das respectivas corporações solicitando
reconhecimento moral, hierárquico, meritório e pecuniário.
Já sob um escopo psicológico, os bombeiros e policiais militares, que
participaram das ações emergenciais durante o acidente, relataram que se
sentem demasiadamente coagidos quando se trata do assunto por três razões
fundamentais: primeiramente, o medo de perder a pensão conseguida a duras
custas sociais e burocráticas em ações intermináveis movidas contra o Estado.
Em segundo lugar, o desconforto dos familiares que se sentem expostos e têm
verdadeiro pavor do preconceito que será imposto a eles e seus familiares se
forem rotulados como “vítimas” do acidente radioativo, numa sociedade que
discrimina, quase que abertamente, esta população. E finalmente, o
sentimento de descrença na saúde, na eficiência e na agilidade das
instituições públicas que deveriam ampará-los.
Sob a ótica do planejamento de contingência em Defesa Civil, os dados
e o conjunto da pesquisa exibiram um elevado grau de confiabilidade para a
adoção de ferramentas a serem utilizadas em eventos que envolvam agentes
genotóxicos. Os órgãos de defesa civil devem, a partir de sistemáticas como 46
essa, incluir a preocupação com o rastreamento e a dosimetria em quaisquer
desastres com qualquer produto perigoso.
Os mecanismos de acionamento, alerta e alarme que são,
rotineiramente, inicializados em face de qualquer risco, ameaça ou desastre
devem incluir as responsabilidades de biodosimetria e desenvolver, num
sentido amplo, a preocupação com todas as vítimas e também com os
envolvidos nas ações pontuais desenvolvidas pelo Sistema de Defesa Civil.
No caso de um desastre de acionamento relativamente tardio, como foi
o caso do césio–137, deve haver uma preocupação com a informação ampla
da população sobre os riscos para que o preconceito seja diminuído e a
disseminação de boatos e pânico contida. Deve haver uma acessibilidade
maior e uma motivação agregada a comoção social para que quaisquer
pessoas, que tiverem a mais irrisória chance de contaminação, procurem os
órgãos de defesa civil, e não se afastem deles no medo do diagnóstico,
preconceito ou tratamento.
Finalmente, os resultados deste estudo demonstraram que os loci STR
são marcadores potentes para o monitoramento retrospectivo da freqüência de
mutações germinativas, na prole de indivíduos expostos a agentes
mutagênicos. Estes marcadores demonstraram a capacidade de se detectar
mutações induzidas, mesmo em amostras populacionais relativamente
pequenas. 47
6. CONCLUSÃO
Pelas análises realizadas em alguns bombeiros e policiais militares,
envolvidos nas ações de segurança e socorro, durante o acidente do césio–
137, em 1987, na cidade de Goiânia – GO, foi concluído, com a aplicação de
questionários, entrevistas e pelos resultados das taxas de mutações
germinativas em loci STR de 11 famílias, que:
• Existiu uma ingenuidade operacional na época, no que tange ao
emprego destes homens, dado que, segundo eles, pouquíssima
informação lhes era passada acerca dos riscos e que não existia
um planejamento, previamente elaborado pela Defesa Civil, para
atuação neste tipo de catástrofe;
• A exposição ocupacional dos bombeiros e policiais militares à
radiação ionizante do césio–137 suscetibilizou a ocorrência de
mutações no DNA, que inclusive foram comprovadas dado que,
20 anos mais tarde, na realização da coleta de dados e material
biológico para este estudo, foi possível encontrar, em valores
relativamente consideráveis, mutações remanescentes desta
exposição, numa área do DNA já conhecida por sua eficiência em
servir de marcador biológico para exposição à radiação;
• A taxa de mutações germinativas em loci STR foi de 0,02;
• A doubling dose calculada para este grupo foi de 0,03 por gene
por Gy.
• Outros estudos deverão ser realizados com mais indivíduos deste
e de outros grupos, no intuito de se utilizar marcadores STR para 48
determinar a exposição à radiação ionizante, dando continuidade
aos estudos de biomonitoramento da população potencialmente e
acidentalmente exposta ao césio–137. 49
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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8. ANEXOS
ANEXO 1
QUESTIONÁRIO PARA SELEÇÃO DOS MILITARES QUE PARTICIPARAM
DAS AÇÕES DE DEFESA CIVIL DURANTE O ACIDENTE DO CÉSIO – 137
EM GOIÂNIA, 1987
“Monitoramento genético retrospectivo de população potencialmente
exposta à radiação ionizante utilizando marcadores STR”
Atenção: Este questionário é um instrumento de pesquisa e
esclarecimento, e será utilizado somente para esta finalidade.
Nome _________ ________________________________________________
Idade: _____________________ Data da entrevista_____________________
Posto/Graduação:______________ RG _______________________________
Contato ( ) _________________ ( ) _________________ OBM _________
01. Participou das ações de socorro durante o acidente
radiológico?
( ) Sim ( ) Não
02. Aproximou-se da fonte de radiação ou dos rejeitos
radioativos?
( ) Sim ( ) Não
03. Foi registrado o índice de radiação recebido? ( ) Sim ( ) Não 55
04. Recebeu atenção médico-hospitalar especializada? ( ) Sim ( ) Não
05. Teve filhos biológicos após o acidente? ( ) Sim ( ) Não
06. Seu(s) filho(s) apresentou (apresentaram)
distúrbio(s) de saúde?
( ) Sim ( ) Não
07. Fuma ou fumou alguma vez na vida? ( ) Sim ( ) Não
08. Bebe ou utilizou bebida alcoólica alguma vez na
vida?
( ) Sim ( ) Não
09. Usou algum medicamento por período prolongado? ( ) Sim ( ) Não
10. Teve algum tipo de câncer? ( ) Sim ( ) Não
11. Possuía alguma doença antes do acidente
radiológico?
( ) Sim ( ) Não
12. Teve filhos biológicos antes do acidente? ( ) Sim ( ) Não
13. Caso a resposta para a questão 1 tenha sido “Sim” responda:
Por quanto tempo? _______________________________________________
Qual era a função? _______________________________________________
14. Caso a resposta para a questão 2 tenha sido “Sim” responda:
Como se aproximou? __________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
15. Caso a resposta para a questão 3 tenha sido “Sim” responda:
Você possui estes registros? ( ) Sim ( ) Não 56
Se não possui, sabe onde estão? ( ) Sim ( ) Não Onde?_____
16. Caso a resposta para a questão 4 tenha sido “Sim” responda:
Onde foi atendido? _______________________________________________
Foi internado? ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? __________
Possui seus registros? __________________________________________
17. Caso a resposta para a questão 5 tenha sido “Sim” responda:
Quantos filhos? ( ) Um ( ) Dois ( ) Três ( ) ____________
Com quantas mulheres?( ) Um ( ) Dois ( ) Três ( ) ____________
A(s) mãe(s) é(são) viva(s)? ( ) Sim ( ) Não
18. Caso a resposta para a questão 6 tenha sido “Sim” responda:
Qual distúrbio(s)? _______________________________________________
19. Caso a resposta para a questão 7 tenha sido “Sim” responda:
Você ainda fuma? ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? __________
A(s) mãe(s) do(s) filho(s) que teve depois do acidente fuma(m)?
Mãe 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? _______________
Mãe 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? _______________
Fumaram? Mãe 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ___ _____
Mãe 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________57
O seu(s) filho(s) nascido(s) após o acidente fuma(m)?
Filho 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ___________________
Filho 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ___________________
Filho 3: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ___________________
Filho 4: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ___________________
Fumaram? Filho 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
Filho 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
Filho 3: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
Filho 4: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
20. Caso a resposta para a questão 8 tenha sido “Sim” responda:
Você ainda utiliza? ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? __________
A(s) mãe(s) do(s) filho(s) que teve depois do acidente utiliza(m)?
Mãe 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? __________________
Mãe 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? __________________
Já utilizaram? Mãe 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo?___
Mãe 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
O seu(s) filho(s) nascido(s) após o acidente utiliza (m)?
Filho 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ____________________
Filho 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ____________________
Filho 3: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ____________________ 58
Filho 4: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ____________________
Já utilizaram? Filho 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo?
Filho 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
Filho 3: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
Filho 4: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
21. Caso a resposta para a questão 9 tenha sido “Sim” responda:
Você ainda usa? ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ____________
A(s) mãe(s) do(s) filho(s) que teve depois do acidente usa(m)?
Mãe 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? __________________
Mãe 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? __________________
Já usaram? Mãe 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? _____
Mãe 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? _____
O seu(s) filho(s) nascido(s) após o acidente usa (m)?
Filho 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? _____________________
Filho 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? _____________________
Filho 3: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? _____________________
Filho 4: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? _____________________
Já usaram? Filho 1: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
Filho 2: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
Filho 3: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________ 59
Filho 4: ( ) Sim ( ) Não Quanto tempo? ________
22. Caso a resposta para a questão 10 tenha sido “Sim” responda:
Você ainda tem? ( ) Sim ( ) Não Qual? __________________
A(s) mãe(s) do(s) filho(s) que teve depois do acidente tem(têm)?
Mãe 1: ( ) Sim ( ) Não Qual? _________________________
Mãe 2: ( ) Sim ( ) Não Qual? _________________________
Já tiveram? Mãe 1: ( ) Sim ( ) Não Qual? _______________
Mãe 2: ( ) Sim ( ) Não Qual? _______________
O seu(s) filho(s) nascido(s) após o acidente tem (têm)?
Filho 1: ( ) Sim ( ) Não Qual? _________________________
Filho 2: ( ) Sim ( ) Não Qual? _________________________
Filho 3: ( ) Sim ( ) Não Qual? _________________________
Filho 4: ( ) Sim ( ) Não Qual? _________________________
Já tiveram? Filho 1: ( ) Sim ( ) Não Qual? _______________
Filho 2: ( ) Sim ( ) Não Qual? _______________
Filho 3: ( ) Sim ( ) Não Qual? _______________
Filho 4: ( ) Sim ( ) Não Qual? _______________
23. Caso a resposta para a questão 11 tenha sido “Sim” responda:
Qual? _________________________________________________________
Por quanto tempo? _______________________________________________ 60
24. Quantos anos de serviço tem ou teve no Corpo de Bombeiros? _____
_______________________________________________________________
25. Em quais áreas e por quanto tempo trabalhou? (Caso tenha executado
serviço de Polícia, especificar nos campos vagos abaixo)
( ) Combate a incêndio ____________________________________________
( ) Salvamento _______________________________________________
( ) Mergulho _______________________________________________
( ) Resgate _______________________________________________
( ) Defesa Civil _______________________________________________
( ) Administração _______________________________________________
( ) ____________________________________________________________
( ) ____________________________________________________________
( ) ____________________________________________________________
26. Como classifica o seu envolvimento com o Acidente do Césio 137?
( ) Pequeno ( ) Médio ( ) Grande ( ) Muito Grande
Por que? _______________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
________________________________________________________ 61
27. Como avalia a atenção e o serviço de saúde e monitoramento dado ao
pessoal de segurança pública e defesa civil durante as ações no desastre
e depois que elas encerraram?
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
_______________________________________________________________
28. Caso a resposta para a questão 5 tenha sido “Sim” responda:
Quantos filhos? ( ) Um ( ) Dois ( ) Três ( ) _______
Com quantas mulheres?( ) Um ( ) Dois ( ) Três ( ) _______
A(s) mãe(s) é(são) viva(s)? ( ) Sim ( ) Não 62
ANEXO 2
TERMO DE CONSENTIMENTO DOS INDIVÍDUOS EXAMINADOS
“Monitoramento genético retrospectivo de população potencialmente
exposta à radiação ionizante utilizando marcadores STR”
I. DADOS DE IDENTIFICAÇÃO DO SUJEITO DA PESQUISA OU
RESPONSÁVEL LEGAL
1. Nome:________________________________________________________
Documento de Identidade__________________ Org. Exp. ______________
Data de nascimento: _____/ ______/ ______
Endereço: ____________________________________________________
Bairro: ______________________ Cidade: ______________ Estado:_____
CEP: _________________ Telefone: ( ) ________________________
2. Responsável legal _____________________________________________
Natureza (grau de parentesco, tutor, curador, etc) ____________________
Documento de identidade _______________________ Sexo: M ( ) F ( )
Endereço: ____________________________________________________
Bairro: ______________________ Cidade: _____________ Estado: ______
CEP: _________________ Telefone: ( ) _________________________ 63
II. DADOS SOBRE A PESQUISA CIENTÍFICA
1. Título do protocolo de pesquisa: Monitoramento genético retrospectivo de
população potencialmente exposta à radiação ionizante utilizando
marcadores STR.
2. Pesquisador responsável: Aparecido D. da Cruz, Superintendência Leide
das Neves Ferreira. Fone: (062) 3946 1086; e-mail: acruz@ucg.br
3. Avaliação do risco da pesquisa: Os procedimentos da pesquisa oferecem
risco mínimo de ocorrência de algum dano imediato ou tardio para o
paciente (apenas hematomas locais após a coleta);
4. Duração da pesquisa: dezembro de 2006 a dezembro de 2007.
III. REGISTRO DAS EXPLICAÇÕES DO PESQUISADOR AO PACIENTE OU
SEU REPERESENTANTE LEGAL SOBRE A PESQUISA
Nós conduzimos um estudo para encontrar provas de contaminação
com o Césio 137. Para isso solicitamos aos membros do Corpo de Bombeiros
que se julgarem de alguma forma afetados com o acidente do Césio 137 em
1987, que contribuam.
A sua participação na pesquisa inclui: a) responder a perguntas de um
questionário; b) doação de amostras de sangue da veia do braço (10 ml). 64
IV. ESCLARECIMENTOS DADOS PELO PESQUISADOR SOBRE
GARANTIAS DO SUJEITO DA PESQUISA
Todas as informações prestadas em questionário e durante a entrevista
serão de caráter confidencial e as informações colhidas serão utilizadas
somente para fins científicos descritos no protocolo desta pesquisa, sem
qualquer identificação pessoal.
Qualquer provável benefício do estudo para o bem–estar da população
depende da exatidão de suas respostas. Portanto, se o Senhor não entender
alguma das questões, por favor, solicite todos os esclarecimentos que julgar
necessário sobre os procedimentos, riscos e benefícios relacionados à
pesquisa ou qualquer dúvida.
Os resultados dos estudos esclarecerão apenas se existe ou não
possibilidade de contaminação com o Césio - 137, sendo necessários outros
estudos para a confirmação. Os sangue que sobrar da coleta será guardado
para que outros exames e estudos sejam feitos no futuro.
O Senhor tem a liberdade de não participar do estudo, saber ou não dos
resultados dos exames, e retirar seu consentimento a qualquer momento
deixando de participar do estudo, sem que isto traga qualquer prejuízo à
continuidade de sua assistência.
Declaro que, após convenientemente esclarecido pelo pesquisador e ter
entendido o que me foi explicado, consinto em participar do presente Protocolo
de Pesquisa em Goiânia, ___/____/_____ Assinatura:_________________ 65
ANEXO 3
CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE
RESOLUÇÃO No 340, DE 8 DE JULHO DE 2004.
O Plenário do Conselho Nacional de Saúde, em sua Centésima
Quadragésima Quarta Reunião Ordinária, realizada nos dias 7 e 8 de julho de
2004, no uso de suas competências regimentais e atribuições conferidas pela
Lei no 8.080, de 19 de setembro de 1990, e pela Lei no 8.142, de 28 de
dezembro de 1990, e
Considerando o recente avanço técnico-científico e suas
aplicações na pesquisa em genética humana, exigindo posicionamento de
instituições, pesquisadores e Comitês de Ética em Pesquisa (CEP) em todo o
País, demandando, portanto, regulamentação complementar à Resolução CNS
No 196/96 (Diretrizes e Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo
Seres Humanos), atribuição da Comissão Nacional de Ética em Pesquisa
(CONEP), conforme item VIII.4 daquela Resolução;
Considerando os subsídios advindos do sistema CEPs – CONEP
e a experiência acumulada na análise dos projetos de pesquisa dessa área até
o momento; e
Considerando a necessidade de serem observados os riscos
potenciais à saúde e a proteção dos direitos humanos, das liberdades 66
fundamentais e do respeito à dignidade humana na coleta, processamento, uso
e armazenamento de dados e materiais genéticos humanos,
R E S O L V E:
Aprovar as seguintes Diretrizes para Análise Ética e Tramitação
dos Projetos de Pesquisa da Área Temática Especial de Genética Humana:
I - Preâmbulo:
A presente Resolução incorpora todas as disposições contidas na
Resolução CNS No 196/96 do Conselho Nacional de Saúde, sobre Diretrizes e
Normas Regulamentadoras de Pesquisas Envolvendo Seres Humanos, da qual
esta é parte complementar da área temática específica, e incorpora também,
no que couber, as disposições constantes das Resoluções CNS Nos 251/97,
292/99, 303/2000 e 304/2000.
II - Termos e Definições:
II.1 - A pesquisa em genética humana é a que envolve a
produção de dados genéticos ou proteômicos de seres humanos, podendo
apresentar várias formas:
a) pesquisa de mecanismos genéticos básicos: estudos sobre
localização, estrutura, função e expressão de genes humanos e da
organização cromossômica;
b) pesquisa em genética clínica: pesquisa que consiste no estudo
descritivo de sujeitos individualmente e/ou em suas famílias, visando elucidar
determinadas condições de provável etiologia genética, podendo envolver
análise de informações clínicas e testes de material genético; 67
c) pesquisa em genética de populações: estudos da variabilidade
genética normal ou patológica em grupos de indivíduos e da relação entre
esses grupos e uma condição particular;
d) pesquisas moleculares humanas: pesquisa que envolve testes
moleculares associados ou não a doenças; estudos genéticos ou epigenéticos
dos ácidos nucléicos (DNA e RNA) ou de proteínas visando a novos
tratamentos ou à prevenção de desordens genéticas, de outras patologias ou à
identificação de variabilidade molecular;
e) pesquisa em terapia gênica e celular: introdução de moléculas
de DNA ou RNA recombinante em células somáticas humanas in vivo (terapia
gênica in vivo) ou células somáticas humanas in vitro e posterior transferência
dessas células para o organismo (terapia gênica ex vivo) e pesquisas com
células-tronco humanas com modificações genéticas; e
f) pesquisa em genética do comportamento: estudo com o
objetivo de estabelecer possíveis relações entre características genéticas e
comportamento humano.
II.2 - Todo procedimento relacionado à genética humana, cuja
aceitação não esteja ainda consagrada na literatura científica, será considerado
pesquisa e, portanto, deverá obedecer às diretrizes desta Resolução. Incluemse procedimentos de genética em reprodução assistida, não regulados pelo
Conselho Federal de Medicina.
III - Aspectos Éticos: 68
A finalidade precípua das pesquisas em genética deve estar
relacionada ao acúmulo do conhecimento científico que permita aliviar o
sofrimento e melhorar a saúde dos indivíduos e da humanidade.
III.1 - A pesquisa genética produz uma categoria especial de
dados por conter informação médica, científica e pessoal e deve por isso ser
avaliado o impacto do seu conhecimento sobre o indivíduo, a família e a
totalidade do grupo a que o indivíduo pertença.
III.2 - Devem ser previstos mecanismos de proteção dos dados
visando evitar a estigmatização e a discriminação de indivíduos, famílias ou
grupos.
III.3 - As pesquisas envolvendo testes preditivos deverão ser
precedidas, antes da coleta do material, de esclarecimentos sobre o significado
e o possível uso dos resultados previstos.
III.4 - Aos sujeitos de pesquisa deve ser oferecida a opção de
escolher entre serem informados ou não sobre resultados de seus exames.
III.5 - Os projetos de pesquisa deverão ser acompanhados de
proposta de aconselhamento genético, quando for o caso.
III.6 - Aos sujeitos de pesquisa cabe autorizar ou não o
armazenamento de dados e materiais coletados no âmbito da pesquisa, após
informação dos procedimentos definidos na Resolução sobre armazenamento
de materiais biológicos.
III.7 - Todo indivíduo pode ter acesso a seus dados genéticos,
assim como tem o direito de retirá-los de bancos onde se encontrem
armazenados, a qualquer momento. 69
III.8 - Para que dados genéticos individuais sejam
irreversivelmente dissociados de qualquer indivíduo identificável, deve ser
apresentada justificativa para tal procedimento para avaliação pelo CEP e pela
CONEP.
III.9 - Nos casos de aprovação de desassociação de dados
genéticos pelo CEP e pela CONEP, deve haver esclarecimento ao sujeito de
pesquisa sobre as vantagens e desvantagens da dissociação e Termo de
Consentimento específico para esse fim.
III.10 - Deve ser observado o item V.7 da Resolução CNS No
196/96, inclusive no que se refere a eventual registro de patentes.
III.11 - Os dados genéticos resultantes de pesquisa associados a
um indivíduo identificável não poderão ser divulgados nem ficar acessíveis a
terceiros, notadamente a empregadores, empresas seguradoras e instituições
de ensino, e também não devem ser fornecidos para cruzamento com outros
dados armazenados para propósitos judiciais ou outros fins, exceto quando for
obtido o consentimento do sujeito da pesquisa.
III.12 - Dados genéticos humanos coletados em pesquisa com
determinada finalidade só poderão ser utilizados para outros fins se for obtido o
consentimento prévio do indivíduo doador ou seu representante legal e
mediante a elaboração de novo protocolo de pesquisa, com aprovação do
Comitê de Ética em Pesquisa e, se for o caso, da CONEP. Nos casos em que
não for possível a obtenção do TCLE, deve ser apresentada justificativa para
apreciação pelo CEP. 70
III.13 - Quando houver fluxo de dados genéticos humanos entre
instituições deve ser estabelecido acordo entre elas de modo a favorecer a
cooperação e o acesso eqüitativo aos dados.
III.14 - Dados genéticos humanos não devem ser armazenados
por pessoa física, requerendo a participação de instituição idônea responsável,
que garanta proteção adequada.
III.15 - Os benefícios do uso de dados genéticos humanos
coletados no âmbito da pesquisa, incluindo os estudos de genética de
populações, devem ser compartilhados entre a comunidade envolvida,
internacional ou nacional, em seu conjunto.
III.16 - As pesquisas com intervenção para modificação do
genoma humano só poderão ser realizadas em células somáticas.
IV - Protocolo de Pesquisa:
IV.1 - As pesquisas da área de genética humana devem ser
submetidas à apreciação do CEP e, quando for o caso, da CONEP como
protocolos completos, de acordo com o capítulo VI da Resolução CNS No
196/96, não sendo aceitos como emenda, adendo ou subestudo de protocolo
de outra área, devendo ainda incluir:
a) justificativa da pesquisa;
b) como os genes/segmentos do DNA ou do RNA ou produtos
gênicos em estudo se relacionam com eventual condição do sujeito da
pesquisa; 71
c) explicitação clara dos exames e testes que serão realizados e
indicação dos genes/segmentos do DNA ou do RNA ou de produtos gênicos
que serão estudados;
d) justificativa para a escolha e tamanho da amostra,
particularmente quando se tratar de população ou grupo vulnerável e de
culturas diferenciadas (grupos indígenas, por exemplo);
e) formas de recrutamento dos sujeitos da pesquisa e de
controles, quando for o caso;
f) análise criteriosa dos riscos e benefícios atuais e potenciais
para o indivíduo, o grupo e gerações futuras, quando couber;
g) informações quanto ao uso, armazenamento ou outros
destinos do material biológico;
h) medidas e cuidados para assegurar a privacidade e evitar
qualquer tipo ou situação de estigmatização e discriminação do sujeito da
pesquisa, da família e do grupo;
i) explicitação de acordo preexistente quanto à propriedade das
informações geradas e quanto à propriedade industrial, quando couber;
j) descrição do plano de aconselhamento genético e
acompanhamento clínico, quando indicado, incluindo nomes e contatos dos
profissionais responsáveis, tipo de abordagens de acordo com situações
esperadas, conseqüências para os sujeitos e condutas previstas. Os
profissionais responsáveis pelo aconselhamento genético e acompanhamento
clínico deverão ter a formação profissional e as habilitações exigidas pelos
conselhos profissionais e sociedades de especialidade; 72
l) justificativa de envio do material biológico e/ou dados obtidos
para outras instituições, nacionais ou no exterior, com indicação clara do tipo
de material e/ou dados, bem como a relação dos exames e testes a serem
realizados. Esclarecer as razões pelas quais os exames ou testes não podem
ser realizados no Brasil, quando for o caso; e
m) em projetos cooperativos internacionais, descrição das
oportunidades de transferência de tecnologia.
V - Termo de Consentimento Livre e Esclarecido (TCLE):
V.1 - O TCLE deve ser elaborado de acordo com o disposto no
capítulo IV da Resolução CNS No 196/96, com enfoque especial nos seguintes
itens:
a) explicitação clara dos exames e testes que serão realizados,
indicação dos genes/segmentos do DNA ou do RNA ou produtos gênicos que
serão estudados e sua relação com eventual condição do sujeito da pesquisa;
b) garantia de sigilo, privacidade e, quando for o caso, anonimato;
c) plano de aconselhamento genético e acompanhamento clínico,
com a indicação dos responsáveis, sem custos para os sujeitos da pesquisa;
d) tipo e grau de acesso aos resultados por parte do sujeito, com
opção de tomar ou não conhecimento dessas informações;
e) no caso de armazenamento do material, a informação deve
constar do TCLE, explicitando a possibilidade de ser usado em novo projeto de
pesquisa.É indispensável que conste também que o sujeito será contatado
para conceder ou não autorização para uso do material em futuros projetos e 73
que quando não for possível, o fato será justificado perante o CEP. Explicitar
também que o material somente será utilizado mediante aprovação do novo
projeto pelo CEP e pela CONEP (quando for o caso);
f) informação quanto a medidas de proteção de dados individuais,
resultados de exames e testes, bem como do prontuário, que somente serão
acessíveis aos pesquisadores envolvidos e que não será permitido o acesso a
terceiros (seguradoras, empregadores, supervisores hierárquicos etc.);
g) informação quanto a medidas de proteção contra qualquer tipo
de discriminação e/ou estigmatização, individual ou coletiva; e
h) em investigações familiares deverá ser obtido o Termo de
Consentimento Livre e Esclarecido de cada indivíduo estudado.
VI - Operacionalização:
VI.1 - Cabe ao CEP, conforme o disposto no capítulo VII da
Resolução CNS No 196/96, a análise dos projetos de pesquisa, assumindo coresponsabilidade no que diz respeito aos aspectos éticos.
VI.2 - Cabe ao CEP devolver de imediato ao pesquisador o
protocolo que não contiver todas as informações relevantes (capítulo VI –
Resolução CNS Nº 196/96, assim como as referidas nos capítulos III e IV da
presente Resolução).
VI.3 - Cabe à CONEP a aprovação final das pesquisas em
genética humana que incluam: 74
a) envio para o exterior de material genético ou qualquer material
biológico humano para obtenção de material genético;
b) armazenamento de material biológico ou dados genéticos
humanos no exterior e no País, quando de forma conveniada com instituições
estrangeiras ou em instituições comerciais;
c) alterações da estrutura genética de células humanas para
utilização in vivo;
d) pesquisas na área da genética da reprodução humana
(reprogenética);
e) pesquisas em genética do comportamento; e
f) pesquisas em que esteja prevista a dissociação irreversível dos
dados dos sujeitos de pesquisa.
VI.4 - Nos casos previstos no item VI.3 acima, o CEP deverá
examinar o protocolo, elaborar o parecer consubstanciado e enviar ambos à
CONEP com a documentação completa conforme a Resolução CNS No
196/96, itens VII.13.a e b e VIII.4.c.1. O pesquisador deve ser informado que
deverá aguardar o parecer da CONEP para início da execução do projeto.
VI.5 - Fica delegada ao CEP a aprovação final dos projetos de
genética humana que não se enquadrem no item VI.3 acima. Nesses casos, o
CEP deve enviar à CONEP a folha de rosto e o parecer consubstanciado final,
seja de aprovação ou não aprovação.
VI.6 - A remessa de material para o exterior deve obedecer às
disposições normativas e legais do País. 75
HUMBERTO COSTA
Presidente do Conselho Nacional de Saúde
Homologo a Resolução CNS No 340, de 8 de julho de 2004, nos
termos do Decreto de Delegação de Competência de 12 de novembro de 1991.
HUMBERTO COSTA
Ministro de Estado da Saúde 76
ANEXO 4
CONSELHO NACIONAL DE SAÚDE
RESOLUÇÃO No 347, DE 13 DE JANEIRO DE 2005
O Plenário do Conselho Nacional de Saúde em sua Centésima
Qüinquagésima Reunião Ordinária, realizada nos dias 11, 12 e 13 de janeiro de
2005, no uso de suas competências regimentais e atribuições conferidas pela
Lei nº 8.080, de 19 de setembro de 1990, e pela Lei nº 8.142, de 28 de
dezembro de 1990, e considerando a necessidade de regulamentar o
armazenamento e utilização de material biológico humano no âmbito de
projetos de pesquisa
RESOLVE:
Aprovar as seguintes diretrizes para análise ética de projetos de
pesquisa que envolva armazenamento de materiais ou uso de materiais
armazenados em pesquisas anteriores:
1. Quando, em projetos de pesquisa, estiver previsto o armazenamento
de materiais biológicos humanos para investigações futuras, além dos pontos
previstos na Resolução CNS nº 196/96, devem ser apresentados:
1.1. Justificativa quanto a necessidade e oportunidade para usos
futuros; 77
1.2. Consentimento dos sujeitos da pesquisa doadores do material biológico,
autorizando a guarda do material;
1.3. Declaração de que toda nova pesquisa a ser feita com o material
será submetida para aprovação do CEP da instituição e, quando for o caso, da
Comissão Nacional de Ética em Pesquisa-CONEP;
1.4. Norma ou regulamento elaborado pela instituição depositária para
armazenamento de materiais biológicos humanos.
2. O material biológico será armazenado sob a responsabilidade de
instituição depositária, a qual deverá ter norma ou regulamento aprovado
pelo CEP dessa instituição, que deverá incluir:
2.1. Definição dos responsáveis pela guarda e pela autorização de uso
do material;
2.2. Mecanismos que garantam sigilo e respeito à confidencialidade
(codificação);
2.3. Mecanismos que assegurem a possibilidade de contato com os
doadores para fornecimento de informação de seu interesse (por exemplo,
resultados de exames para acompanhamento clínico ou aconselhamento
genético) ou para a obtenção de consentimento específico para uso em novo
projeto de pesquisa;
3. O armazenamento poderá ser autorizado pelo período de 5 anos,
quando houver aprovação do projeto pelo CEP e, quando for o caso, pela
CONEP, podendo haver renovação mediante solicitação da instituição
depositária, acompanhada de justificativa e relatório das atividades de
pesquisa desenvolvidas com o material. 78
4. No caso de pesquisa envolvendo mais de uma instituição, deve
haver acordo entre as instituições participantes, contemplando formas de
operacionalização e de utilização do material armazenado.
5. No caso de armazenamento e/ou formação do banco de material
biológico no Exterior, deve ser obedecida à legislação vigente para remessa de
material para o Exterior e ser apresentado o regulamento para análise do CEP
quanto ao atendimento dos requisitos do item II.
5.1. O pesquisador e instituição brasileiros deverão ser considerados
como cotistas do banco, com direito de acesso ao mesmo para futuras
pesquisas. Dessa forma, o material armazenado não poderá ser considerado
como propriedade exclusiva de país ou instituição depositária.
6. Sobre o uso de amostras armazenadas:
6.1. Amostras armazenadas podem ser usadas em novas pesquisas
aprovadas pelo CEP e, quando for o caso, pela CONEP;
6.2. Os protocolos de pesquisa que pretendam utilizar material
armazenado devem incluir:
a) Justificativa do uso do material;
b) Descrição da sistemática de coleta e armazenamento, com definição
de data de início ou período;
c) Cópia do Termo de Consentimento Livre e Esclarecido-TCLE obtido
quando da pesquisa em que foi colhido o material, incluindo autorização de
armazenamento e possível uso futuro, se o armazenamento ocorreu a partir
de pesquisa aprovada depois da Resolução CNS nº 196/96; e 79
d) TCLE específico para nova pesquisa: em caso de impossibilidade da
obtenção do consentimento específico para nova pesquisa (doador falecido,
tentativas anteriores de contato sem sucesso ou outros) devem ser
apresentadas as justificativas como parte do protocolo para apreciação do
CEP, que dispensará ou não o consentimento individual.
6.3. No caso de material biológico para cujo armazenamento se dispõe
de normas da ANVISA, as mesmas devem também ser observadas.
HUMBERTO COSTA
Presidente do Conselho Nacional de Saúde
Homologo a Resolução CNS No 347, de 13 de janeiro de 2005, nos
termos do Decreto de Delegação de Competência de 12 de novembro de
1991.
HUMBERTO COSTA
Ministro de Estado da Saúde80
ANEXO 5
PROTOCOLO DE COLETA DE SANGUE
Separar os seguintes materiais:
1. Seringas de 10 mL;
2. Heparina (para evitar a coagulação do sangue no interior da seringa);
3. Garrote;
4. Descartex (recipiente adequado para fazer descarte de materiais
cortantes;
5. Material para assepsia;
6. Tubos Falcon® de 15 mL (para armazenamento).
Procedimento:
1. “Heparinizar” a seringa;
2. Colocar agulha esterilizada;
3. Fazer assepsia do braço do paciente;
4. “Garrotear” o braço do paciente;
5. Punçar a veia e coletar;
6. Retirar o garrote;
7. Retirar a agulha do braço do paciente;
8. Retirar a agulha da seringa;
9. Colocar a agulha utilizada no recipiente adequado;
10. Desprezar a amostra no Tubo Falcon®;
11. Homogeneizar a amostra; 81
12. Descartar a seringa em recipiente adequado;
13. Identificar a amostra.
Processamento da amostra:
1. Colocar, balanceadamente, as amostras na centrífuga;
2. Centrifugar, por 20 minutos, a 3000 rpm (rotações por minuto), ou maior
rotação disponível;
3. Retirar as amostras da centrífuga;
4. Identificar os tubos de 2 mL que vão armazenar a amostra;
5. Retirar o “anel leucocitário” e transferi-lo para o tubo de 2 mL
identificado;
6. Congelar a amostra a, no máximo, - 20ºC ou proceder à extração de
DNA. 82
ANEXO 6
PROTOCOLO DE EXTRAÇÃO DE DNA
O Kit Easy – DNA permite que se isole fácil e rapidamente um DNA
Genômico de alto peso molecular e variedade de tipos e tamanhos de
amostras. O procedimento permite que se isole o DNA Genômico de muitas
amostras de sangue em menos de 30 minutos. O DNA isolado é pronto para
análise por PCR ou RFLP.
Antes de começar:
1. Separe tubos de 2 mL para microcentrífuga;
2. Equilibre o “Banho – Maria” em 65ºC.
Isolamento do DNA:
1. Pipetar 350 µL de sangue em cada tubo. As amostras de sangue devem
ser misturadas para formar uma solução homogênea;
2. Adicionar 500 µL da solução “A” no tubo. Misturar por inversão;
3. Incubar a 65ºC por 6 minutos;
4. Remover a amostra do “Banho – Maria” e homogeneizar por inversão;
5. Adicionar 900 µL de Clorofórmio e agitar (Vortex). Certificar – se de que
a amostra está completamente misturada. A amostra está completa
quando corre livremente e as hemoglobinas parecem pequenos flocos
de chocolate; 83
6. Adicionar 200 µL da solução “B” e agitar (Vortex) até que a amostra
fique uniformemente viscosa;
7. Centrifugar à velocidade máxima utilizando uma microcentrífuga por 10
minutos em temperatura ambiente;
8. Pipetar o limpo, fase aquosa, para um novo tubo de microcentrífuga 1,5
mL.
Precipitação do DNA genômico:
1. Adicionar 1 mL de Etanol 100% à temperatura ambiente e misturar por
inversão até a formação do precipitado. O precipitado é visto,
normalmente, após 30 a 60 segundos. Se o precipitado não for visto,
deixar os tubos incubarem a temperatura ambiente por 10 minutos;
2. Centrifugar à velocidade máxima em uma microcentrífuga, à
temperatura ambiente, por 5 minutos;
3. Decantar o sobrenadante e adicionar 1 mL de Etanol a 70% à
temperatura ambiente;
4. Centrifugar à velocidade máxima numa microcentrífuga por 1 minuto à
temperatura ambiente;
5. Decantar o sobrenadante. Centrifugar à velocidade máxima numa
microcentrífuga por 1 minuto à temperatura ambiente;
6. Remover o Etanol residual com uma pipeta e inverter os tubos para que
sequem;
7. Adicionar 100 – 150 µL de água “ultra – pura” (autoclaved nuclase – free
water) em cada tubo;
8. Incubar a 65ºC por 5 minutos; 84
9. Fazer gel de Agarose a 1,5% e submeter à eletroforese;
10. Eletroforese deverá ser a 100 V e por 30 minutos;
11. Corar gel com Brometo de Etídio por 5 minutos para verificar a presença
e integridade do DNA (atenção: se houver uma banda destacada, é sinal
da integridade da amostra, caso seja um arraste, pode significar que o
DNA está degradado. 85
ANEXO 7
PROTOCOLO DE PCR E ELETROFORESE
Preparo da Solução para PCR (por amostra):
1. Adicionar 8,35 µL de Água ultra – pura;
2. Adicionar 1,25 µL de Tp Gold;
3. Adicionar 1,25 µL de Primer;
4. Adicionar 0,4 µL de Taq-DNA Polimerase;
5. Adicionar 1,25 µL da amostra a ser amplificada.
Variação da temperatura no Termociclador:
1. 1º Ciclo:
a. Elevar e manter a 95ºC por 11 minutos;
b. Elevar e manter a 96ºC por 2 minutos;
2. 2º Ciclo (repetir 10 vezes consecutivas):
a. Abaixar (no início) ou elevar (nas outras vezes) e manter a 94ºC
por 1 minuto;
b. Abaixar e manter a 60ºC por 1 minuto;
c. Elevar e manter a 70ºC por 1 minuto e 30 segundos;
3. 3º Ciclo (repetir 22 vezes consecutivas):
a. Elevar e manter a 90ºC por 1 minuto;
b. Abaixar e manter a 60ºC por 1 minuto;
c. Elevar e manter a 70ºC por 1 minuto e 30 segundos; 86
4. 4º Ciclo
a. Abaixar a 60ºC por 30 minutos;
b. Finalizar e permanecer a 4ºC.
ELETROFORESE
1. Preparar o MEGABACE 1000® para receber as amostras, executando
os procedimentos de limpeza dos capilares e configuração para
genotipagem;
2. Levar as amostras ao Termociclador e aquecê-las a 95ºC por 5 minutos
para desnaturar o DNA, então colocá-las no gelo para aguardarem a
eletroforese;
3. Introduzi-las no MEGABACE 1000® com os seguintes parâmetros de
injeção:
a. 3 KV por 80 segundos e;
b. 9 KV por 75 minutos.
4. Em seguida, coletar os dados armazenados no computador, e analisá-
los com o software Fragment Profiler. 87
ANEXO 8
ARTIGO SUBMETIDO À PUBLICAÇÃO
Research paper
Microsatellite mutations in children from Cesium-137 accident liquidators
Bráulio Cançado Flores 1,2,3, Daniela de Melo e Silva* 2,3, Emília Oliveira Alves
Costa2,3, Luciana Abrahão Ramos3
, Marília Gomes Ismar3
, Aparecido Divino da Cruz2,3
1 Corpo de Bombeiros Militar do Estado de Goiás/Diretoria de Defesa Civil (DIDEC).
Av. Anhanguera, n. 7364, Setor Aeroviário, CEP 74435-800, Goiânia, Goiás, Brazil
2
Secretaria Estadual de Saúde de Goiás/Superintendência Leide das Neves
Ferreira/Laboratório de Citogenética Humana e Genética Molecular (LaGene). Rua 16-
A n. 792, Setor Aeroporto, Cep 74075-150, Goiânia, Goiás, Brazil
3
Universidade Católica de Goiás/Departamento de Biologia/Núcleo de Pesquisas
Replicon, Rua 235 n. 40, Setor Universitário, Cep 74605-010, Goiânia, Goiás, Brazil.
*Correspondence should be addressed to D.M.S (e-mail: danielamelo@ucg.br;
Telephone number: 556239461086; Fax number: 556239461385)88
Abstract
We performed a study on few Brazilian liquidators, verifying whether increase in the
frequencies of germline mutations at microsatellite loci could be found in their
progeny. These liquidators were involved, during September of 1987, in clean-up
operations, in the most serious radiological accident occurred in the western
hemisphere, when a radiotherapy unit containing 50.9 TBq of Cs137Cl was removed
from an abandoned clinic and it was subsequently disassembled. This accident exposed
hundreds of people to non-natural environmental radiation. To evaluate the effects of
low radiation doses, we compared the microsatellite mutation rates of 11 families of
liquidators and 300 controls. A total of 12 microsatellite loci (11 autossomal and one
X-linked) were used. DNA was isolated from peripheral blood lymphocytes and the
microsatellite loci were amplified by the polymerase chain reaction with fluorescencelabelled primers. Mutations were detected as variations in the length of the loci. At the
autossomal loci, the mutation rates (expressed as number of mutations among the total
number of loci for the individuals included) are 2 x 10-2 (11/528, exposed group) and
6.9 x10-4 (10/14400, control group). This difference is significant and showed an
increase of approximately 29 times in the mutation rates of the exposed group. These
results indicated the possibility that the liquidators of the Cesium-137 accident might
have been unexpectedly exposed to some radioactive contaminants in the environment,
once the spontaneous mutation rates, in several non-exposed Brazilian individuals,
differ to those in the group of liquidators. Unfortunately, the mean radiation doses,
possibly absorbed to the liquidators, were not evaluated, but our results are consistent
with an effect of radiation on microsatellite mutations.
Keywords: Cesium-137; liquidators, mutation rate; microsatellite mutations. 89
1. INTRODUCTION
A single accidental event such as the removal of a highly radioactive 137Cesium
source (50.9 TBq or 1.375 Ci) [1,2], from an abandoned radiotherapy clinic in Goiânia,
Brazil, on September 13, 1987, can exposed hundred of people to substantial doses of
ionizing radiation. Upon the discovery of the accident, over 120,000 people were
screened and the civil defense worked hardly in the contaminated area and tried to help
the accidentally exposed people [2].
According to some estimates, the absorbed doses of the individuals accidentally
exposed was estimated and ranged from near 0 up to 7 Gy. Emergency actions were
taken to clean and control further exposure and contamination, generating a total of
3,500 m3 of waste. The civil defense agents comprised of firemen and police officers,
also known as liquidators, thought, in a first moment that it was a gas escapement and
they didn’t protect themselves against radiation. Latter, they were employed at security
and cleanness of the irradiated areas, being exposed frequently, without protection, to
residual radiation [3]. Such accident had major medical, social-economical and
physiological impacts in the community, leaving the government to grapple with
political fallout. For a major review on the accident and genetic long-term studies of the
exposed population refer to [1], [2] and [4].
Previous follow-up study of the Goiânia population accidentally exposed to Cs-
137 using offspring investigation provided us the opportunity to view the genetic traces
of radiation exposure in a human population [4]. Previously, cytogenetic and molecular
endpoints were used to understand the genetic effects of this kind of exposure [5 – 7].
The potential induction of somatic microsatellite instability by ionizing radiation was
also investigated in the Goiânia population and the results indicated that mismatch
repair deficiency could be compatible with cell development [1, 4]. Our group also
investigated the genetic effects of STR mutations in the offspring of irradiated fathers, 90
nineteen years after the Cesium-137 accident, and it was found that the absorbed doses
elevated the germline mutations 0.03 times [4].
Trying to continue such genetic investigations, in this study, we used 16 STR
markers, and we selected 12 STR markers which exhibited the most accurate results.
Such molecular markers are largely used in paternity tests and they are used to infer if
radiation exposure could cause an increase in the frequency of microsatellite mutation
in the offspring of liquidators occupationally exposed to ionizing radiation. The allelic
sequences in parents and their offspring possibilities the estimation of the inheritance
of a mutation event. A mutation event is typically recognized as a shift in allelic
mobility assessed by electrophoretic separation of differently sized alleles[9].
Hereafter we reported the results of a case-control study carried out in 11 families
for which the father was occupationally exposed to Cesium-137 ionizing radiation. We
obtained the mutation frequency in STR loci of exposed and control groups and we also
tested whether ionizing radiation could cause paternal genetic mutations that are
transmitted to the offspring in the liquidators group. 91
2- MATERIAL AND METHODS
2.1. Samples analyses
A total of 11 families comprised of 39 individuals were studied, including the
parental generation and their offspring. The parental generation included 7 firemen and
4 policemen occupationally exposed to ionizing radiation. The exposed group
contained 16 children, including 7 girls and 9 boys, mostly conceived after the Goiânia
accident and born between 1987 and 2005 (Table 1). The control group comprised of
300 paternity cases, 900 individuals, whose genetic link was performed during the
years of 2000 to 2004. All DNA tests had a probability of paternity of at least 99.99%.
All participants contributed voluntarily with 10 mL of peripheral blood collected in
vacutubes containing sodium heparin.
2.2. DNA isolation and PCR
We isolated the genomic DNA from blood samples using Easy DNA Genomic
Kit (Invitrogen, USA) and stored at -20o
C until analysis. The PowerPlex® 16 System
was used to co-amplify twelve loci, including: CSF1PO, D8S1179, FGA, Amelogenin,
vWA, D18S51, Penta E, TH01, D13S317, D5S818, D3S1358 and TPOX. The ability to
perform STR analysis from a single amplification resulted in increased efficiency and
sample conservation, as well as a reduction in sample handling and the potential
laboratory error associated with it. All PCR product separations were performed by
capillary electrophoresis using MegaBACE 1000 Automatic Genotyping (GE
HealthCare®). The capillary runs were analyzed using the software Fragment Profiler v.
1.0 (Amersham Biosciences®), which performs automatic sizing and allele calling. All
electropherograms were manually reviewed prior to analyses. 92
2.3. Spectrum of microsatellite mutation
Father-mother and children sets were compared to analyze a mutational
germline event and to infer whether Cesium-137 radiation exposure led to mutations in
germ cells that resulted in changes in the length of microsatellite repetitive DNA
sequences. It was considered to be a de novo germ-cell mutation each variant in a child
that is not observed in either biological parent. The progenitor allele was assumed to be
the paternal allele closest in size to the mutant allele as in previous studies [10]. Chisquare tests were performed using the BioEstat® version 3.0, in order to evaluate a
significant difference (p< 0.05) between controls and exposed patients, related to the
number of germline mutation and mutation rates.93
3. RESULTS
When the radioaccident happened, the mean age of the exposed fathers was 26
years old and the mean age of the mothers was 21 years old. Data from 300 usual cases
(900 individuals) living in the State of Goias, undergoing paternity/maternity DNA
testing to establish the frequency of germline mutations in the 12 STR loci, were used
as controls.
We estimated the doubling dose (DD) to evaluate the potential human hazard of
Cesium-137 exposure. This is defined as the amount of radiation required to produce as
many mutations as those that occur in a generation as a result of spontaneous mutations.
It is calculated as a ratio of the average rates of spontaneous and induced mutations in a
set of defined gene loci [11].
The rate of spontaneous mutations represents the mean of the STR mutation
rates in the control group (6.9 x10-4). For our exposed liquidators group, the ratio of
induced mutations in the 12 loci was 2 x 10-2
.
The target population could not be divided in ethnic groups as the level of
admixture is very high in Brazil. So, germline mutations in STR loci of the exposed
groups were evaluated for the origin of the mutations (maternal or paternal origin), age
and sex of the F1individual, and length of the allele core.
A total of 1248 alleles were genotyped by PCR and 936 were analyzed in the
exposed group. The vast majority of microsatellite mutations represented gains of
entire repeat units, a hallmark of replication slippage [8-13]. So, the probabilities of
addition and deletion are identical and constant across the alleles, assuming the
classical stepwise mutation model for microsatellites [14]. Tables 02 and 04 summarize
the data for the exposed and Tables 03 and 05 summarize the data for the controls. 94
According to our results, the first generation of the exposed liquidators group
showed 2 mutations in the loci CSF1PO, D8S1179 and FGA, presenting a mutation rate
of 0.045 each one. Except Amelogenin, vWA and D18S51, the other markers showed
only one mutation and the frequency of microsatellite mutation in their offspring was
0.023 each one.
We also analyzed 900 individuals in the control group, totalizing 21,600 alleles.
We found 10 germline mutational events and a total mutation rate of 0.00069. D13S317
presented the highest mutational rate with 3 events, D16S539 and D7S820 showed 2
mutations, vWA and LPL showed only one. In the control group 60% of the mutations
were paternally derived, 30% were derived from the mother and 10% could be from
either parent. Mutation distribution between parents has previously been discussed by
other authors [8,9] who argue that the identification of de novo mutations in
hypermutable markers by pedigree analysis suggested a male: female mutation rate of
2:1. All controls included in the current study had a cumulative paternity index of
99.99%. The mean age of mothers and fathers in the control group it was 24 and 31
years old, respectively.
Chi-square tests showed that neither mother´s age nor father´s age both in
control or exposed groups had no effect in germline mutation frequency (p= 0.16 and
p= 0.17, respectively). A possible effect of the core sequence in germline mutation
frequency in both groups was also investigated. However, no evidence of parental allele
size on mutation frequency of their offspring was observed (p =0.24)
In the current study, unfortunately we had no data about the individual absorbed
doses of the liquidators. Such doses were not evaluated when the liquidators worked at
the emergency actions of Cesium-137 accident. 95
Most mutation events involved the gain or loss of only one repeat unit and in the
control group there was only one case that the child STR core lost 4 nucleotides.
However, the incidence of such mutations, involving gain or loss of repeat units, was
not distinct in both groups (1 gain, 9 losses and in 1 case it could be gain or loss in
exposed; against 1 gain, 7 losses and in 2 cases it could be gain or loss in control; χ
2
= 8,
d.f.=2 , P=0.01). So, we therefore conclude that there is not a difference in the spectrum
of paternal microsatellite mutations between these groups. 96
4. DISCUSSION
We found 11 mutations in the paternal generation of the exposed liquidators
group comprised of 39 individuals and only 10 mutations in 900 people of the control
group. According to our results, there was an evidence of radiation effect on mutation
rate at hypervariable microsatellite loci in the germ cells of radiation exposed survivors.
Our findings contrast with other groups, in which no effect of radiation on micro- and
minisatellites mutations were found [15, 17, 18, 21], but agree with others [4, 20, 25,
27].
Human microsatellites mutate much more frequently than coding sequences, a
characteristic that make them attractive to population screening for genetic effects of
mutagenic agents and several studies have detected and observed the potential genetic
effects of radiation at the DNA level in the children of people who were exposed [15-
27], but the genetic effects of radiation in humans remain largely undefined[15-17].
In this study, all the mutations were of paternal origin, once just the fathers
worked at civil defense activities, when the radiological accident happened. Mutations
rate did not increase with paternal age, since in the control group, the parents presented
mean ages higher than the exposed group.
The minisatellite mutation rates in the germline of irradiated fathers from the
Techa River population was significantly elevated and it could be attributed to the
influence of ionizing radiation, once the control and exposed groups were matched by
ethnicity, parental age, occupation and smoking habitats [27]. Unfortunately, we did not
match our group according to the factors cited above, but our and previous results with
Goiania’s exposed population demonstrated that the increased in the frequency of
microsatellite mutations in the offspring can be explained mostly by ionizing radiation. 97
Despite the very discrete size of our exposed group, we found an increase in the
number of new alleles in the offspring of exposed individuals, when compared with the
control group. Even occupational absorbed doses of radiation could induce multiple
changes in germline DNA, as the parental generation was contaminated directly by
Cesium-137. Our results demonstrate that microsatellite loci, as minisatellites [25],
provide powerful systems for the efficient retrospective monitoring of germline
mutation in humans and are capable of detecting induced mutations in small population
samples, being an easy, efficient and rapid assay to verify germline mutation.
Following a study initiated at 2006 [4] , our group intention was to compare
and to find out if, even with the occupational liquidators exposure, during the
actions of civil defense, microsatellites could give results similar to the Chernobyl
liquidators [18], in contradiction to another studies carried out in the exposed
population of Ucrania [15]. We found an evidence for an increased mutation rate in
microsatellites, indicating that mutation rate could be increased by radiation
exposure.
Although we found an influence of paternal radiation exposure on
microsatellite germline mutations, further investigations might be carried out to
improve our results. 98
5. Acknowledgments
The authors wish to thank Genetic Master’s Teaching Staff for their assistance in the
last two years, and our university colleagues who help us in the collection of the blood
samples and DNA analysis. This work was supported by several grants, including
Corpo de Bombeiros Militar do Estado de Goiás, Secretaria Estadual da Saúde de Goiás
and Pró-Reitoria de Pós-Graduação e Pesquisa PROPE)/Universidade Católica de
Goiás. 99
5. REFERENCES
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Exposed to Ionizing Radiation of Cesium-137 in Goiânia (Brazil), Ph.D Thesis
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irradiated parents nineteen years after the Cesium-137 accident, Mutat. Res. 652
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[5] A.D. da Cruz ; A.G. McArthur , C.C Silva, M.P. Curado, B.W.Glickman.
Humans micronucleus counts are correlated age, smoking and cesium-137 dose in
the Goiânia (Brazil) radiological accident, Mutat. Res. 313 (1994) 57-68.
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Minisatellite germline mutation rate in the Techa River population, Mutat. Res. 602
(2006) 74-82. 103
Table 1.
Birth years of the children of the exposed group
Children Birth year Presence of STR mutations
1 1987 +
2 1989 +
3 1988 -
4 1995 +
5 1989 +
6 1991 +
7 1998 -
8 1987 -
9 1990 -
10 1995 -
11 1998 -
12 1991 +
13 1991 +
14 1999 -
15 1992 -
16 2005 - 104
Table 2. Whole set of mutational data for each STR locus in the exposed group
Microsattelite
locus
Number
of paternal
mutations
Number
of
maternal
mutations
Number of
paternal or
maternal
mutations
(undetermined
type of
mutation)
Number of children
and number of alleles analyzed
D18S51 - - -
Penta E 1 - -
TH01 1 - -
CSF1PO 1 1 -
D13S317 1 - -
D5S818 1 - -
D8S1179 - - 2
Amelogenin - - -
D3S1358 - - -
FGA 2 - -
TPOX 1 - -
Vwa - - -
Total 8 1 2
16 children
(192 alleles) 105
Table 3. Whole set of mutational data for each STR locus in the control group
Microsattelite locus Number
of paternal
mutations
Number of
maternal
mutations
Number of paternal
or maternal
mutations
(undetermined type
of mutation)
Number of
children/ alleles
analyzed
D7S820 2 - -
D13S317 1 1 1
D16S539 2 - -
CSF1PO - - -
TPOx - - -
TH01 - - -
F13A01 - - -
FESPS - - -
vWA 2 - -
LPL - - 1
F13B - - -
HPRTB - - -
Total 7 1 2
300 children/
3600 alleles 106
Table 4.
Characteristics of the group exposed to CsCl-13
Case Mother alleles Child alleles Father alleles Mutated Locus Mutation rate
04 12,13 10,13 11,14 Penta E 0,023
13 7,9 7,8 9,11 TH01 0,023
12 11,13 10,11 12,12
05 13,14 11,12 11,12
CSF1PO 0,045
13 12,12 11,12 12,13 D13S317 0,023
13 10,12 10,13 12,14 D5S818 0,023
01 13,14 12,13 13,14
02 13,14 12,14 13,14
D8S1179 0,045
01 20,23 23,23 20,24
04 21.2,21.2 21.2,25 23,26
FGA 0,045
06 8,12 12,13 11,12 TPOx 0,023 107
Table 5.
Characteristics of the control group, according to mutated locus and mutation rate/locus
Case Mother alleles Child alleles Alleged father Mutated Locus Mutation rate
A74
A143
11,13
11,12
12,13
10,12
11,11
9,12 D16S539 0.0017
A103 8,12 8,11 10,12
A112 8,10 10,11 12,12 D7S820 0.0017
A91 11,14 9,13 9,11
A161 11,11 9,10 9,10
A488 9,14 8,13 8,12
D13S317 0.0025
A117 17,18 15,18 16,17
A773 14,16 11,14 15,16 vWA 0.0017
A655 9,10 10,11 10,10 LPL 0.0008 108
ANEXO 9
COMPROVANTES DE RECEBIMENTO DA REVISTA CIENTÍFICA
From: "Mutation Research"
To:
Sent: Monday, June 23, 2008 10:01 AM
Subject: Submission Confirmation
Dear Daniela,
Your submission entitled "Microsatellite mutations in children from Cesium-137
accident liquidators" has been received by Mutation Research - Genetic
Toxicology and Environmental Mutagenesis
You may check on the progress of your paper by logging on to the Elsevier
Editorial System as an author. The URL is http://ees.elsevier.com/mutgen/.
Your username is: Danielamelo
Your password is: ***********
Your manuscript will be given a reference number once an Editor has been
assigned.
Thank you for submitting your work to this journal.
Kind regards,
Elsevier Editorial System
Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis 109
From: "Mutation Research"
To:
Sent: Monday, June 23, 2008 10:33 AM
Subject: A manuscript number has been assigned: MUTGEN-D-08-00191
Ms. Ref. No.: MUTGEN-D-08-00191
Title: Microsatellite mutations in children from Cesium-137 accident liquidators
Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis
Dear Daniela,
Your submission entitled "Microsatellite mutations in children from Cesium-137
accident liquidators" has been assigned the following manuscript number:
MUTGEN-D-08-00191.
You may check on the progress of your paper by logging on to the Elsevier
Editorial System as an author. The URL is http://ees.elsevier.com/mutgen/.
Your username is: Danielamelo
Your password is: **********
Thank you for submitting your work to this journal.
Kind regards,
Brigitte Neilson
Journal Manager
Mutation Research - Genetic Toxicology and Environmental Mutagenesis
Fonte: "
http://tede.biblioteca.ucg.br/tde_busca/arquivo.php?codArquivo=523""
